氨基甲酸乙酯在醬油發酵過程中的形成機理研究

白曉娟，高榮錕

(1.晉中職業技術學院，山西 晉中 030600；2.山西農業大學，山西 晉中 030801)

氨基甲酸乙酯是酒精飲料和發酵醬油中的一種常見物質，其形成過程復雜。可通過對醬油中氨基甲酸乙酯前體物質的含量控制來間接控制其生成過程，利用生化方法可直接檢測醬油中氨基甲酸乙酯前體物質含量變化[1,2]。

本文研究氨基甲酸乙酯在醬油發酵過程中的形成機理，通過對醬油發酵不同階段的氨基甲酸乙酯含量和其前體物質尿素、精氨酸、瓜氨酸和鳥氨酸的含量進行檢測，建立氨基甲酸乙酯與其前體物質之間的變化關系，來獲取醬油中氨基甲酸乙酯的形成機理。

1 氨基甲酸乙酯介紹

氨基甲酸乙酯是一種酯類物質，并含有大量的氨基酸，是一種無色晶體，無臭味，易溶解于水和乙醇中[3]。氨基甲酸乙酯在醫藥合成過程中具有廣泛的用途，同時也是一種麻醉劑。氨基甲酸乙酯可通過粉塵或者飲食過程進入人體，是淋巴癌或肺癌的主要致癌點[4]。氨基甲酸乙酯可作為農藥的中間體，用于化工領域，同時可用于麻醉劑的生產過程中。

在醬油發酵過程中隨著氨基甲酸乙酯前體物質的不斷變化，而產生不同特性的氨基甲酸乙酯[5]。氨基甲酸乙酯的前體物質主要包含尿素、精氨酸、鳥氨酸和瓜氨酸，前體物質在醬油釀造過程中的變化規律具有一定的相關性[6]。

2 氨基甲酸乙酯前體物質檢測

在醬油發酵過程中，從第10天開始，每隔10 d提取醬油發酵樣品，直至整個醬油發酵周期完成。對提取的醬油發酵樣品采用8層紗布進行過濾，獲得液態醬汁，分別取10 g后進行固相萃取及標準檢測處理[7,8]。在兩種檢測試驗條件下分別檢測其中的氨基甲酸乙酯、尿素、精氨酸、瓜氨酸和鳥氨酸含量，其中一組添加酵母，一組不添加酵母，每種成分的檢測進行3組試驗檢測，取其平均值。

本文所用的發酵醬油原材料為豆粕和麩皮，所選酵母為魯氏酵母，酵母培養基中添加0.3 g酵母浸粉，0.6 g葡萄糖，0.6 g蛋白胨以及少量的水，并在115 ℃條件下進行滅菌。

在醬汁中，尿素可被酵母吸收，形成尿素的循環代謝。當醬汁中的精氨酸含量抑制了酵母細胞的代謝時，尿素無法進行有效的代謝循環，此時酵母細胞中的尿素排入醬汁[9]。尿素無臭無味，可溶于酒精和水中，是醬油發酵過程中微生物的主要氮物質來源。對于尿素的檢測主要通過測量有色物質溶液的顏色來進行組分檢測，將光度計的檢測結果換算成尿素含量。尿素的檢測波長為422 nm，測量范圍可達到8.8～107 mg/L。醬汁中尿素含量變化曲線見圖1。

圖1 尿素含量變化曲線

由圖1可知，在醬油發酵過程中，醬汁中的尿素整體含量先下降后上升。在發酵初期，尿素含量不斷降低，第30天時，在不添加酵母的醬汁中尿素含量為18 mg/L，在添加酵母的醬汁中尿素含量為8 mg/L。從第30天開始，酵母自身開始產生尿素，因此醬汁中的尿素含量不斷上升，不添加酵母的醬汁中尿素含量明顯高于添加酵母的醬汁中尿素含量。

隨著醬油發酵時間的推移，醬汁中的微生物將大分子蛋白質進行分解，產生精氨酸、瓜氨酸和鳥氨酸，該類氨基酸是氨基甲酸乙酯的前體物質[10]。醬汁中精氨酸、瓜氨酸和鳥氨酸含量的變化規律決定了醬汁中氨基甲酸乙酯的含量。

精氨酸可在堿性溶液中發生反應，生成次氯酸鹽等橙紅色物質，進一步通過比色法來進行精氨酸含量檢測。醬汁中精氨酸含量變化曲線見圖2。

圖2 精氨酸含量變化曲線

由圖2可知，在醬油發酵過程中，醬汁中的精氨酸整體含量先上升后下降，隨著發酵時間的不斷推移，醬汁中的精氨酸含量變化逐漸平緩。不添加酵母的醬汁中精氨酸在第30天達到最大值3300 mg/L，添加酵母的醬汁中精氨酸在第70天達到最大值2700 mg/L。在發酵初期，醬汁中微生物不斷分解蛋白質，使精氨酸含量上升，隨著醬油原料物質中蛋白質的逐漸減少和微生物對精氨酸進行分解，精氨酸含量逐漸降低，并最終趨于平緩。發酵初期，因酵母對精氨酸的代謝作用，添加酵母的醬汁中精氨酸含量低于未添加酵母的醬汁中精氨酸含量。發酵后期，添加酵母的醬汁中精氨酸減少速度低于未添加酵母的醬汁中精氨酸減少速度。

瓜氨酸可在酸性條件下生成丁二酮，并在強酸環境中發生縮合，形成紅色的化合物。瓜氨酸含量變化曲線見圖3。

圖3 瓜氨酸含量變化曲線

由圖3可知，在未添加酵母的醬汁中，瓜氨酸含量先上升后下降再上升，并在發酵后期達到近似平緩狀態，在發酵第30天時，瓜氨酸達到最大值3750 mg/L。在添加酵母的醬汁中，瓜氨酸含量逐漸上升，在發酵第60天時達到平緩狀態。由此說明酵母抑制了瓜氨酸的增長，使瓜氨酸變化規律為逐漸上升并最終處于平緩狀態。

鳥氨酸可在茚三酮混合性酸性溶液的顯色作用下，發生水浴反應，并在510 nm波長照射下，進行鳥氨酸測定。鳥氨酸含量變化曲線見圖4。

圖4 鳥氨酸含量變化曲線

由圖4可知，醬汁中鳥氨酸含量逐漸上升后下降，并最終基本處于平緩狀態，鳥氨酸含量在第50天時達到最大值，且添加酵母的醬汁中鳥氨酸含量高于未添加酵母的醬汁中鳥氨酸含量，其主要原因是在醬油發酵過程中，酵母可以分解醬汁中的蛋白物質，產生鳥氨酸。

3 氨基甲酸乙酯與尿素及氨基酸關系

在醬油生產過程中，對氨基甲酸乙酯的控制是通過對其前體物質的控制來研究的，各物質之間存在相互轉化過程，并共同影響醬汁中氨基甲酸乙酯的形成。為此在未添加酵母的條件下，建立醬汁中氨基甲酸乙酯與其前體物質之間的變化關系。氨基甲酸乙酯不易揮發，溶解度較小，在較高的壓力下形成蒸汽。氨基甲酸乙酯可在展開溶劑的條件下，利用362 nm波長的紫外光進行照射，形成藍紫色的熒光斑點，對醬汁中的氨基甲酸乙酯進行半定量分析。

為研究醬油中氨基甲酸乙酯與尿素之間的關系，本文將醬汁中的尿素與氨基甲酸乙酯含量變化過程進行對比。氨基甲酸乙酯與尿素之間的關系曲線見圖5。

由圖5可知，隨著醬油發酵過程的進行，醬汁中氨基甲酸乙酯含量與尿素含量都出現上升狀態，且變化趨勢基本相同。在醬油發酵的開始階段，尿素作為發酵過程中的氮源，隨著微生物的代謝，尿素外排，醬汁中的尿素含量發生變化。醬汁中的氨基甲酸乙酯與尿素之間存在一定的關系，且尿素含量越高，氨基甲酸乙酯的含量越高。

為研究醬油中氨基甲酸乙酯與氨基酸之間的關系，本文分別將醬汁中的精氨酸、瓜氨酸和鳥氨酸與氨基甲酸乙酯含量變化過程進行對比。氨基甲酸乙酯與精氨酸、瓜氨酸和鳥氨酸之間的關系曲線見圖6。

圖6 氨基甲酸乙酯與氨基酸的關系

由圖6可知，隨著醬油發酵過程的進行，氨基甲酸乙酯含量逐步上升；精氨酸含量先上升后下降；鳥氨酸含量逐步上升，并最終處于平穩狀態；瓜氨酸含量逐步上升，并最終處于平穩狀態。在醬油的發酵過程中，精氨酸逐步被生物分解利用，含量逐步降低，根據醬汁中氨基酸的組合排布形式，初步預測精氨酸代謝途徑，隨著精氨酸的分解，瓜氨酸和鳥氨酸含量逐步上升，表明瓜氨酸存在其他的代謝過程。因為幾種氨基酸之間存在相互轉化，因此氨基酸之間的相對含量共同影響氨基甲酸乙酯的形成過程。

4 結論

尿素、精氨酸、瓜氨酸和鳥氨酸作為醬油氨基甲酸乙酯的前體物質，其變化規律可間接反映氨基甲酸乙酯的形成規律。在醬油發酵初期，尿素含量快速降低，隨著發酵過程的進行，尿素含量逐步上升，其中氨基甲酸乙酯的含量也逐步上升，表明醬汁中尿素促進了氨基甲酸乙酯的形成。在發酵初期，精氨酸、瓜氨酸和鳥氨酸含量逐步升高，發酵中前期下降，并開始逐步上升，最終處于平穩狀態，氨基甲酸乙酯含量逐步上升，在發酵后期基本處于平穩狀態。表明幾種氨基酸前體物質含量與氨基甲酸乙酯含量之間的變化趨勢基本相同，隨著發酵過程中微生物的作用，相互關系之間存在一定的波動性。