響應面優化石榴皮安石榴苷提取工藝及其抗氧化活性研究

常占瑛，劉桂花，古麗巴合爾·卡吾力，開維賽爾阿婭·阿卜力克木，高曉黎，*

（1.新疆醫科大學藥學院，新疆烏魯木齊830011；2.新疆維吾爾自治區藥物研究所，新疆烏魯木齊830004）

作為一種重要的食用水果，石榴（Punicagranatum L.）又名安石榴、山力葉、丹若等，落葉喬木或灌木；單葉，通常對生或簇生，無托葉。石榴皮收錄于中國藥典，具有潤腸止瀉、止血、驅蟲的功效。石榴皮中的生物活性化合物非常多，如鞣質類（石榴皮中鞣質的含量高達25%～30%）[1]、類黃酮及原花青素類化合物，其中安石榴苷是石榴皮鞣質中重要的成分[2]，含量在10%左右[3]。安石榴苷為棕黃色不定型粉末，極性強，易溶于水，可溶于乙醇等有機溶劑，能跟多種化學試劑發生顯色反應，是逆沒食子酸鞣質的一種，分子式為C48H28O30，相對分子質量為1 084.72，存在一對同分異構體，并且二者能夠相互轉換[4]。安石榴苷具有最強的抗氧化性[5-6]、抗癌細胞增殖[7]、抗腫瘤[5]以及降血脂作用[8]等。

目前石榴皮多酚的提取主要以回流提取[9]、浸提[10]、微波輔助提取[11-13]、超聲波輔助提取[14-15]等方法為主，而以安石榴苷含量為指標，采用超聲波輔助提取較少，本試驗采用Box-behnken響應面設計利用超聲波輔助提取安石榴苷工藝進行優化。并通過測定安石榴苷提取物清除DPPH自由基、羥自由基（·OH）、超氧陰離子自由基（·O2-）以及ABTS+·4種自由基的能力，分析其抗氧化活性，以期為安石榴苷更廣泛和深入的研究提供技術參考和理論依據，促進安石榴苷進一步開發應用。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

和田石榴皮（陰干）：和田市麥迪森維吾爾醫藥公司，經新疆醫科大學藥學院帕麗達教授鑒定為石榴科石榴屬石榴Punicagranatum L.的果皮。

安石榴苷對照品 （純度大于98.82%，批號：MUST-18030501）：成都曼斯特生物科技有限公司；三氟乙酸：成都市科隆化學品有限公司；三羥甲基氨基甲烷（Tris）溶液：上海源葉生物科技有限公司；水楊酸：天津市北聯精細化學品開發有限公司；30%H2O2溶液：天津市大茂化學試劑廠；DPPH試劑：梯希愛化成工業發展有限公司；硫酸鐵、三氯化鐵：天津市致遠化學試劑有限公司；抗壞血酸、ABTS試劑：北京索萊寶科技有限公司；過硫酸鉀：上海山浦化工有限公司。以上均為分析純。

Agilent-1220高效液相色譜儀：美國安捷倫公司；FW135型高速萬能粉碎機：北京市永光明醫療儀器有限公司；New Classic MF分析天平、LE104E/02電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；KQ500DE型超聲波清洗器：江蘇省昆山市超聲儀器；SHB-Ш循環水式真空泵：鄭州長城科工貿有限公司；Milli-Q艾柯超純水儀：美國密理博公司。

1.2 方法

1.2.1 安石榴苷的含量測定

1.2.1.1 色譜條件

色譜柱：Agilent SB-C18（4.6mm×250mm，5μm）；流動相為0.1%三氟乙酸∶甲醇，梯度洗脫條件：0～10min，95% ∶5%；10 min～25 min，80% ∶20%；25 min～35 min，55% ∶45%；35 min～45 min，35% ∶65%；檢測波長370 nm；流速 1 mL/min；進樣量 10 μL；柱溫 30 ℃[16]。

1.2.1.2 對照品溶液的制備

稱取安石榴苷對照品6.06 mg，置10 mL容量瓶中，加入60%乙醇待全部溶解后定容，倍量稀釋。用0.22 μm的微孔濾膜過濾，備用。

1.2.1.3 供試品溶液的制備

稱取適量石榴皮粉末，加入一定量乙醇，超聲處理，提取次數，過濾，合并濾液倒入250 mL容量瓶中，定容至刻度；倍量稀釋。用0.22 μm的微孔濾膜過濾，備用。

1.2.1.4 線性關系考察

將對照品儲備液倍量稀釋，配制成不同濃度的水溶液，進樣10 μL，以峰面積對濃度進行線性回歸，得回歸方程：y=70 502x+348 994，R2=0.998 4，安石榴苷濃度在4.734 μg/mL～303.0 μg/mL范圍內與其峰面積呈良好的線性關系。

1.2.2 單因素試驗

在乙醇濃度分別為0%、20%、40%、60%、80%，料液比分別為 1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30（g/mL），提取時間 15、30、45、60 min，超聲功率 80、120、160、200 W，提取次數1、2、3次的條件下，按照1.2.1.3的方法，進行乙醇濃度、料液比、提取時間、超聲功率、提取次數5個因素對提取石榴皮安石榴苷含量的影響試驗。

1.2.3 響應面法優化石榴皮安石榴苷超聲提取工藝的試驗設計

在單因素試驗結果上，采用響應面法，對超聲輔助提取石榴皮安石榴苷的影響因素進行研究和條件優化，做出響應面圖，建模并分析各因素對響應值的影響[17-18]。

1.2.4 安石榴苷提取物體外抗氧化性試驗

1.2.4.1 安石榴苷提取物對DPPH自由基清除作用

參考李珊珊等[19]的方法測定，以VC為對照，測定安石榴苷提取物對DPPH自由基的清除作用。

1.2.4.2 安石榴苷提取物對·OH清除作用

參考張婉君等[20]的方法測定，以VC為對照，測定安石榴苷提取物對·OH的清除作用。

1.2.4.3 安石榴苷提取物對·O2-清除作用

參考廖國會等[21]的方法測定，以VC為對照，測定安石榴苷提取物對·O2-的清除作用。

1.2.4.4 安石榴苷提取物對ABTS+自由基清除作用

參考李卓瓦等[22]的方法測定，以VC為對照，測定石榴皮安石榴苷提取物對ABTS+自由基的清除作用。

2 結果與分析

2.1 高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）方法的建立

測定安石榴苷粗提樣品和對照品的色譜圖如圖1所示。

圖1 HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram

2.2 單因素試驗

2.2.1 乙醇濃度的考察

在料液比 1 ∶25（g/mL）、提取 30 min、提取 1 次、超聲功率為200 W的條件下，乙醇濃度對石榴皮安石榴苷含量的影響結果見圖2。

圖2 乙醇濃度對石榴皮安石榴苷含量的影響Fig.2 Effects of ethanol concentration on the content of punicalagin in pomegranate peel

由圖2可知，乙醇濃度對安石榴苷濃度大小有顯著影響，隨著乙醇濃度的增大，安石榴苷提取率先升高后降低。其中乙醇濃度為60%時安石榴苷含量最高，因此選擇60%的乙醇作為提取溶劑進行后續試驗。

2.2.2 料液比的考察

在60%的乙醇、提取30 min、提取1次、超聲功率為200 W的條件下，料液比對石榴皮安石榴苷含量的影響結果見圖3。

圖3 料液比對石榴皮安石榴苷含量的影響Fig.3 Effects of solid/liquid ratio on the content of punicalagin in pomegranate peel

由圖3可知，料液比對安石榴苷濃度大小有顯著影響，在料液比為1∶25（g/mL）之前，隨著溶劑的增加，安石榴苷含量逐漸增大，料液比為1∶30（g/mL）時與1∶25（g/mL）時差別不大，但考慮到試劑與環保等問題，選擇料液比1∶25（g/mL）進行后續試驗。

2.2.3 提取時間的考察

在60%的乙醇、料液比1∶25（g/mL）、提取1次、超聲功率為200 W的條件下，提取時間對石榴皮安石榴苷含量的影響結果見圖4。

由圖4可知，提取時間對安石榴苷含量大小有顯著影響，45 min以后安石榴苷的含量有所下降，可能是隨著時間的延長，安石榴苷降解。因此選擇提取時間為45 min進行后續試驗。

圖4 提取時間對石榴皮安石榴苷含量的影響Fig.4 Effects of extracting time on the content of punicalagin in pomegranate peel

2.2.4 超聲功率的考察

在60%的乙醇、料液比 1∶25（g/mL）、提取 45 min、提取1次的條件下，超聲功率對石榴皮安石榴苷含量的影響結果見圖5。

圖5 提取功率對石榴皮安石榴苷含量的影響Fig.5 Effects of extraction of power on the content of punicalagin in pomegranate peel

由圖5可知，安石榴苷含量隨著提取功率的增大而緩慢升高，其中200 W時安石榴苷含量相對較高，因此后續試驗中選擇超聲功率200 W。

2.2.5 提取次數的考察

在60%的乙醇、料液比 1∶25（g/mL）、提取 45 min、超聲功率為200 W的條件下，提取次數對石榴皮安石榴苷含量的影響結果見圖6。

圖6 提取次數對石榴皮安石榴苷含量的影響Fig.6 Effects of extraction times on the content of punicalagin in pomegranate peel

由圖6可知，提取次數對安石榴苷濃度大小幾乎沒有影響，隨著提取次數的增加，安石榴苷含量略有降低，可能是在過濾時有損耗，其中提取1次時安石榴苷含量相對最高，因此后續試驗提取1次。

綜上所述，以上因素都能影響石榴皮中安石榴苷提取濃度大小，結合單因素試驗結果，在后續響應面試驗中選取對安石榴苷提取濃度影響顯著的3個因素，即乙醇濃度、提取時間和料液比，在最優范圍分別設置3個水平進行響應面優化。

2.3 響應面試驗

根據單因素試驗結果，選取對安石榴苷提取濃度影響顯著的3個因素，每個自變量選擇3個水平，以-1、0、1進行編碼，采用Box-behnken中心組合試驗設計原理，以安石榴苷的濃度為響應值進行三因素三水平的試驗設計，對提取工藝進行響應面優化。響應面試驗設計因素與水平編碼見表1，試驗設計及結果見表2。

表1 響應曲面試驗設計因素水平Table 1 Factors and levels of response surface test design

表2 響應曲面試驗方案及結果Table 2 Design and result for response surface experiment

應用Design-expert 8.0.6軟件處理表2數據，經回歸擬合得到安石榴苷超聲波提取工藝條件的回歸方程。

對回歸方程進行回歸分析，結果見表3所示。

表3 響應曲面回歸方程模型的方差分析Table 3 Variance analysis of the fitted regression model

由方差分析可以看出，模型P值＜0.000 1，表明該模型方程高度顯著。模型失擬項P值0.105 2＞0.05，模型失擬項不顯著，說明該回歸模型與試驗數據擬合程度較高，試驗誤差較小，可以用該模型分析石榴皮中安石榴苷含量提取工藝。且模型擬合度R2=0.989 7，大于90%，表明回歸方程對安石榴苷濃度的預測值與實際值有比較好的相關性。在一次項的檢驗中，自變量A高度顯著，自變量B極顯著，自變量C不顯著；各自變量的交互項均不顯著；二次項的檢驗中，A2、B2達到高度顯著，C2極顯著。

響應面圖直觀地反映了任意2個因素對安石榴苷濃度的影響，具體交互影響結果見圖7。

在響應面圖中，響應面坡度越陡峭，則表明響應值越敏感。從響應面坡度來看，乙醇濃度與料液比和提取時間的曲線走勢都比較陡峭，說明乙醇濃度對安石榴苷濃度大小的影響最顯著，單個因素對安石榴苷提取率的影響大小順序為乙醇濃度＞提取時間＞料液比，這與方差分析結果一致。響應面試驗最優工藝條件為：乙醇濃度為 63.38%，1 ∶26.42（g/mL）的料液比提取40.39 min，預測安石榴苷含量為88.08 mg/g，實際操作中稍作調整，確定的最佳提取工藝條件為：乙醇濃度 63%，料液比 1 ∶26（g/mL），超聲提取時間 40 min。在最優工藝條件下提取3批樣品，測定安石榴苷含量分別為 88.12、88.28、88.09 mg/g，與預測值相符，說明優化結果可信。

圖7 響應曲面圖和等高線圖Fig.7 Response surface and contour chromatograms

2.4 安石榴苷提取物體外抗氧化性試驗

2.4.1 安石榴苷提取物對DPPH自由基清除作用

安石榴苷提取物對DPPH自由基的清除作用，結果見圖8。

圖8 安石榴苷提取物及VC對DPPH自由基的清除作用Fig.8 Scavenging effect on DPPH free radical of punicalagin extract and VC

DPPH是一種較為穩定的自由基，廣泛應用于抗氧化成分的抗氧化活性評價[23]。由圖8可以看出，VC及安石榴苷提取物均對DPPH自由基有一定的清除作用，而且對DPPH自由基的清除能力均與濃度劑量有關系，安石榴苷提取物對DPPH自由基的清除能力略高于VC。DPPH自由基清除率對安石榴苷提取物、VC濃度的回歸方程分別為：y=117.156 3x+38.177 7（R2=0.992 3），y=100.698 1x+36.739 5（R2=0.991 8），由此回歸方程得到對應的DPPH自由基清除率50%時，所需要的VC和安石榴苷提取物濃度依次為131.7 μg/mL和 101.0 μg/mL。

2.4.2 安石榴苷提取物對·OH清除作用

安石榴苷提取物對·OH的清除作用，結果見圖9。

圖9 安石榴苷提取物及VC對·OH的清除作用Fig.9 Scavenging effect on·OH of punicalagin extract and VC

由圖9可以看出，對照品VC與安石榴苷提取物均對·OH有一定的清除作用，而且對·OH的清除能力均與濃度有劑量關系，0.2 mg/mL濃度以上，安石榴苷提取物清除率高于VC。·OH清除率對安石榴苷提取物、VC濃度的回歸方程分別為：y=185.1587x+7.9876（R2=0.9964），y=59.125 5x+24.380 5（R2=0.997 4），由此回歸方程得到對應的·OH清除率50%時，所需要的VC和安石榴苷提取物濃度依次為433.4 μg/mL和227.0 μg/mL。

2.4.3 安石榴苷提取物對·O2-清除作用

安石榴苷提取物對·O2-的清除作用，結果見圖10。

由圖10可以看出，對照品VC及安石榴苷提取物均對超氧陰離子自由基有一定的清除作用，而且對超氧陰離子自由基的清除能力均與濃度有劑量關系，其中安石榴苷提取物對超氧陰離子自由基的清除率略低于VC。超氧陰離子自由基清除率對安石榴苷提取物，VC濃度的回歸方程分別為：y=150.200 1x-1.312 4（R2=0.991 6），y=148.657 3x+8.279 0（R2=0.993 3），由此回歸方程得到對應的超氧陰離子自由基清除率50%時，所需要的VC和安石榴苷提取物濃度依次為280.8 μg/mL 和 341.6 μg/mL。

圖10 安石榴苷提取物及VC對·O2-的清除作用Fig.10 Scavenging effect on·O2-of punicalagin extract and VC

2.4.4 安石榴苷提取物對ABTS+自由基清除作用

安石榴苷提取物對ABTS+自由基的清除作用，結果見圖11。

圖11 安石榴苷提取物及VC對ABTS+自由基的清除作用Fig.11 Scavenging effect on ABTS+free radical of punicalagin extract and VC

由圖11可以看出，對照品VC與安石榴苷提取物均對ABTS+自由基有一定的清除作用，而且對ABTS+自由基的清除能力均與濃度有劑量關系。ABTS+自由基清除率對安石榴苷提取物、VC濃度的回歸方程分別為：y=1.794 8x-14.267 7（R2=0.997 3），y=1.402 2x+1.181 1（R2=0.997 2），由此回歸方程得到對應的超氧陰離子自由基清除率50%時，所需要的VC和安石榴苷提取物濃度依次為34.82 μg/mL和35.81 μg/mL。

3 結論

對石榴皮安石榴苷提取工藝進行優化，得到優化工藝條件為：乙醇濃度 63%，料液比 1∶26（g/mL），超聲提取時間40 min，超聲功率200 W，提取1次，在此條件下，安石榴苷含量為（88.16±0.10）mg/g。

安石榴苷做為石榴皮多酚中主要有效成份，大量研究表明石榴多酚具有抗氧化活性[24-25]。在本次試驗中，安石榴苷提取物對于DPPH自由基、OH自由基清除率IC50略低于VC，而其對ABTS+自由基和超氧陰離子自由基的IC50略高于VC，表明安石榴苷提取物具有較好的清除DPPH自由基和OH自由基的能力。