骨髓間充質干細胞向視網膜光感受器樣細胞誘導分化探討

陳金國 徐國興 白 月 徐 巍 郭 健

骨髓間充質干細胞向視網膜光感受器樣細胞誘導分化探討

陳金國 徐國興 白 月 徐 巍 郭 健

福建醫科大學附屬第一醫院，福建省眼科研究所

目的：探討體外培養的大鼠骨髓間充質干細胞(rat mesenchymal stem cells，rMSCs)誘導分化成視網膜光感受器樣細胞的能力。方法：用貼壁篩選法分離、培養SD大鼠骨髓MSC細胞，經流式細胞儀鑒定后，利用光感受器細胞培養上清液誘導MSC細胞14 d。用免疫細胞化學染色和Rt-PCR觀察誘導后的細胞是否表達視紫紅質（Rhodopsin）、神經元特異性烯醇化酶(NSE)，膠質纖維酸性蛋白（GFAP）。結果：誘導細胞14d后即可見有神經元樣細胞出現，實驗組MSC的Rhodopsin表達率為35.1%±6.2 %，而對照組中無Rhodopsin陽性的細胞, 實驗組MSC的NSE表達率為33.6%±4.0 %，對照組為10.6%±5.0%, 實驗組MSC的GFAP表達率為9.6%±1.5 %，對照組為13.7%±3.0 %。RT-PCR鑒定結果分析示實驗組MSC的GFAP、NSE、Rhodopsin mRNA均有表達，而對照組的只表達GFAP和NSE，未見Rhodopsin條帶。結論：體外培養的rMSC，經過視網膜光感受器細胞培養上清液導，可以分化為視網膜光感受器樣細胞。

骨髓間充質干細胞 光感受器細胞 誘導分化

骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cell，MSC)，是一群具有多向分化潛能的均質性成體干細胞，它具有兩項干細胞最顯著的生物學特性：自我更新 (self-renewa1)能力及多向分化潛能。1968年, Friedenstein[1]等學者首先報告骨髓中存在一種細胞具有高度的自我更新能力和多向分化潛能,他們認為這種細胞可能是間充質細胞的前體。隨著研究的發現，MSC具有向中內外胚層組織細胞分化的能力 ,可以在體外被誘導分化為肌肉細胞、成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、成纖維細胞、肝細胞、上皮細胞、神經細胞等[2, 3]。近年來，BMSCs向神經元細胞的分化的研究成為了研究的熱點?？衫每寡趸瘎?、生長因子、維甲酸、共培養等將骨髓間充質干細胞誘導成神經樣細胞[4-6]。本文探索了利用視網膜光感受器培養上清液體外誘導BMSCs分化為視網膜光感受器樣細胞的可行性。

1 材料和方法

1.1 材料

清潔級健康Sprague-Dawley（SD）大鼠20只40眼，重量100~125g，購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司； DMEM培養基(美國Hyclone公司) ，Neurobasal培養基（美國Invitrogen公司），B27(美國Invitrogen公司) ，胎牛血清（美國Hyclone公司），0.25％胰蛋白酶（美國Hyclone公司），木瓜蛋白酶（美國sigma公司），多聚賴酸（美國sigma公司），小鼠抗大鼠單CD34-FITC、CD44-PE和CD90-PE，以及相應同型對照單抗小鼠IgG1-FITC, IgG1-PE和IgG2a –PE（Beckman-Coulter公司），神經元特異性標志小鼠抗大鼠醇化酶（美國 Fisher Scientific公司），光感受器特異性標志小鼠抗大鼠單克隆抗體視紫質(Rhodopsin)（RET-P1，美國Millipore公司），星形膠質細胞特異性標志小鼠抗大鼠單克隆抗體神經膠質酸性蛋白(GFAP)（美國 Fisher Scientific公司），DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋公司），總抽提試劑盒（上海生工生物工程技術服務有限公司），THERMO FORMA 3111 CO2培養箱（美國），OLYMPUS 1×70熒光倒置式相差顯微鏡（日本），OLYMPUS BH-2型光學顯微鏡（日本），Beckman-Coulter Epics XL 流式細胞儀（美國），臺式高速冷凍離心機（上海），Gene Amp 9700型PCR 擴增儀（美國），Bio-Rad凝膠成像分析系統（Gel DOC2000）（美國），AIR-TECH BCM-1000A型生物潔凈工作臺（蘇州）。

1.2 方法

1.2.1骨髓間充質干細胞的分離培養和鑒定

取清潔級SD大鼠，4mL／kg水合氯醛 (100g/L)進行腹腔麻醉。碘伏消毒，無菌條件下取出大鼠的雙側脛骨和股骨，分別剪斷股骨干和脛骨中間及兩端的干骺剪斷，用含有肝素的培養液10mL進行反復沖洗骨髓腔，沖洗液經200目不銹鋼標準篩網過濾組織塊以及已凝血塊后，進行離心后用20%FBS的DMEM培養基制成單細胞懸液接種于25cm2培養瓶中，24h后首次換液去除未貼壁細胞，以后每2d換液一次，換液前PBS洗去部分未貼壁細胞，當70％～80％細胞達到融合時用0.25%胰蛋自酶消化傳代，進行擴增培養。用流式細胞儀檢測細胞表面抗原CD34、CD44和CD90的表達[7]。

1.2.2視網膜光感受器細胞的分離培養和鑒定

在暗環境下無菌取下清潔級SD大鼠的眼球，游離出完整的視網膜神經上皮層。利用木瓜蛋白酶進行消化分離出光感受器細胞，用Neurobasal培養基A 1mL（加入1:50的B27和0.5mM L-glutamine）進行避光培養，兩天換液一次，將視網膜光感受器細胞培養換液的上清液收集于干凈玻璃瓶中，通過0.22um過濾篩過濾后按2:3比例與DMEM培養液混合后備用。分別把消化前和消化后的視網膜片進行HE染色,在顯微鏡下觀察，同時對分離的光感受器細胞進行免疫細胞化學鑒定。

1.2.3對大鼠骨髓間充質干細胞進行誘導以及鑒定

將3代的rMSCs接種在6孔板中。分為2個對照組，4個實驗組。實驗組加入光感受器細胞上清液與10%FBS的DMEM培養基（2:3）進行誘導，對照組用Neurobasal培養基A與10%FBS的DMEM培養基（2:3）進行培養，在倒置相差顯微鏡下觀察細胞的生長及分化情況，誘導后14天，行免疫細胞化學和Rt-PCR鑒定，免疫細胞化學：PBS洗滌3次，多聚甲醛固定，0.2％Triton-X作用10 min，過氧化酶阻斷，非免疫動物血清孵育 10 min，加Rhodopsin(1:100), NSE(1:200) ,GFAP(1:100)抗體，4℃過夜，加入生物素標記的第二抗體，鏈霉菌抗生物素蛋白－過氧化物酶溶液，DAB溶液顯色，蘇木素復染，中性樹膠封固，在顯微鏡下觀察。RT—PCR法檢測實驗組和對照當中的GFAP，NSE， Rhodopsin的表達。Rhodopsin引物上游引物ATGTTCGTGGTCCACTTCA3’，下游引物5’ CGTTGTCCTCAGCCGATG 3’，擴增長度為107bp；NSE引物上游引物：5’ CTGTGGTGGAGCAGGAGA 3’，下游引物5’ GGGAGATAGCGGTGTAAC 3’，擴增長度為156bp；GFAP引物上游引物：5’TAGGAGTGGTAGGGCAGACTTG3’，下游引物5’GCAACCAGGAATAGACCTTCACAA 3’，擴增長度為482bp；內參Rat GAPDH 為5’CAGTGCCAGCCTCGTCTC 3’，BC050110為5’ AGGGGCCATCCACAGTCTTC 3’，擴增長度為595bp。參照TRIZOL試劑說明書對誘導的MSC分別提取總RNA，進行反轉錄、PCR擴增，將 PCR產物電泳后進行圖像分析儀采集圖像。

統計學處理：采用SPSS13.0統計軟件包(statistical package for the social science)分析，采用t檢驗。

2 結果

2.1 骨髓間充質干細胞的鑒定

培養的大鼠的BMSCs接種后24小時開始貼壁，前3天細胞增殖慢，數量比較少，第3開始細胞的增長速度明顯增加，7天后就達到融合狀態，呈現漩渦狀、菊花狀。第三代時，細胞仍呈梭形，生長旺盛。BMSCs標志鑒定結果表明，培養的第三代BMSCs干細胞表面標志CD90陽性（CD90+/CD34-：92%），基質細胞表面標志CD44陽性（CD44+/CD34-：93%）（見圖1）。

圖1 大鼠MSC流式細胞儀檢測結果（A: CD90+/CD34-：92%;B: CD44+/CD34-：93%)

2.2 視網膜光感受器細胞的鑒定

取下來的視網膜在消化前后分別進行HE染色，消化前可以很清楚地觀察到九層細胞，說明取下來的是完整的視網膜神經上皮層，不含有色素上皮，消化后的視網膜片，光感受器層的細胞變少，其它層細胞完整，光感受器細胞的免疫細胞化學示，光感受器細胞的特異標志物視紫紅質的表達率達95%以上。

2.3 大鼠骨髓間充質干細胞的誘導

實驗組BMSCs誘導后的第4天細胞形態開始變化，可見小的突起。隨后細胞便圓，突起增長，出現少量神經樣細胞的形態，到14天最為明顯，出現一、二級分支，相互之間連接呈網狀。對照組也有少量的細胞呈神經樣的形態。誘導后的神經元樣細胞GFAP，NSE，Rhodopsin呈強陽性。非神經元樣細胞呈多邊形或梭形，上述抗體染色呈弱陽性。陰性對照未見染色。

免疫細胞化學鑒定，共培養2周后，陽性細胞計數結果顯示： rMSC的Rhodopsin表達率實驗組為35.1%±6.2 %（圖2A）,而對照組中無Rhodopsin陽性的細胞（圖2B）， rMSC的NSE表達率實驗組為33.6%±4.0 %（圖3A），對照組為10.6%±5.0%（圖3B）, rMSC的GFAP實驗組的表達率為9.6%±1.5 %（圖4A），對照組為：13.7%±3.0 %（圖4B）；對照組與實驗組進行兩樣本的t檢驗NSE：F =0.09，方差齊，P < 0.001，有統計學意義，GFAP：F =1.726，方差齊，P ＞0.05，無統計學意義。

A:實驗組大量表達Rhodopsin(×100)；B:對照組未表達Rhodopsin(×100)

A:實驗組大量表達NSE(×100)；B:對照組少量表達NSE(×100)

A:實驗組表達有GFAP(×100)；B：對照組表達有GFAP(×100)

RT-PCR鑒定結果分析顯示，實驗組MSC的GFAP、NSE、Rhodopsin均有表達，其中GFAP表達比較弱；而對照組的只表達GFAP和NSE，且均較弱，未見Rhodopsin條帶(圖5)。

A:為實驗組，GFAP、NSE、Rhodopsin均有表達；B:為對照組，只表達GFAP和NSE。

3 討論

本實驗模擬視網膜體內發育的微環境誘導骨髓間充質干細胞成為視網膜細胞，利視網膜光感受器細胞培養上清液對骨髓間充質干細胞進行向視網膜樣細胞誘導。本實驗關于視紫紅質的檢測，實驗組表達率高達35.1 %±6.2 %，對照組沒有表達，說明其光感受器條件培養基能使MSC向光感受器細胞方向轉化。從而驗證了大鼠MSC確實可以在體外被誘導為表達視紫紅質的光感受器樣細胞，Tomita M[8]研究表明不管是利用BDNF, NGF, and bFGF或與視網膜片共培養，均未發現表達Rhodopsin的證據。Anthony等[5]對BMSCs向視網膜光感受器細胞誘導分化進行了體內外實驗。利用維甲酸、?；撬岷虴GF體外將小鼠 BMSCs成功誘導為視網膜光感受器樣細胞，誘導后的細胞可以表達視網膜光感受器細胞特異性標志物：視紫紅質、視蛋白和恢復蛋白，最近國內學者單純用EGF也可以誘導rMSC表達Rhodopsin[9]。本實驗當中NSE表達率也明顯高于對照組，而GFAP，兩組表達并無差異，說明，光感受器條件培養基促進rMSC向神經元細胞方向分化，而對于膠質細胞方向分化并無誘導作用。本實驗的對照并未加誘劑的rMSC也能表達神經元特異性標志，Tomita M[8]研究說明沒有生長因子誘導的MSC沒有向神經方向分的證據，強調生長因子在神經分化中的重要地位，但是也有許多學者提出了在未誘的條件下仍發現神經特異性標志物的表達，Tondreau T等[10]發現未誘的的MSC也可以表達神經特異標記物，如Nestin和β微管蛋白Ⅲ，酪氨酸羥化酶等。Deng J[11]研究中也證實，體外培養大鼠的MSC具有自發表達早期的神經標記物(如Nestin和β微管蛋白Ⅲ)，也有細胞表達成熟神經細胞的標記物，如神經微絲M（FNM），這些跟本實驗對照組仍能誘導的MSC能表達NSE相一致。

我們的實驗利用光感受器細胞上清液模擬視網膜體內發育的微環境誘導骨髓間充質干細胞成為視網膜光感受器樣細胞，視網膜神經細胞培養上清液可能在骨髓間充質干細胞的存活與分化方面起重要作用。盡管BMSC向神經細胞分化的研究已獲得了一些令人鼓舞的結果，但是還面對了許多待進一步解決的問題：（1）對于BMSC的鑒定一直都沒有一個統一的說法，對BMSC的細胞學特點和分化各階段細胞標志物的進一步研究；（2）光感受器細胞在體外的外節容易脫落變性，如何進一步保持其完整性以及存活時間；（3）體外BMSC向視網膜樣細胞誘導分化模式和分子調控機制還不甚清楚，其誘導的微環境還比較復雜，有的學者直接采用雞尾酒式的加入好幾種生長因子進行誘導，對于其中各生長因子具體作用以及相互間的作用仍不清楚；（4）對于本實驗誘導出來表達視紫紅質的MSC細胞的與真正的光感受器細胞之間不管是從形態上還是都有很大的差距，縮短這一差別，將MSC真正應用于眼科臨床，還需進一步深入的研究探索。

[1] Friedenstein AJ, Petrakova KV, Kurolesova AI, et al. Heterotopic of bone marrow. Analysis of precursor cells for osteogenic and hematopoietic tissues[J]. Transplantation, 1968,6(2):230-247.

[2] Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells[J]. Science, 1999,284(5411):143-147.

[3] Bianco P, Riminucci M, Gronthos S, et al. Bone marrow stromal stem cells: nature, biology, and potential applications[J]. Stem Cells, 2001,19(3):180-192.

[4] Woodbury D, Schwarz EJ, Prockop DJ, et al. Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons[J]. J Neurosci Res, 2000,61(4):364-370.

[5] Kicic A, Shen WY, Wilson AS, et al. Differentiation of marrow stromal cells into photoreceptors in the rat eye[J]. J Neurosci, 2003,23(21):7742-7749.

[6] Ullian EM, Sapperstein SK, Christopherson KS, et al. Control of synapse number by glia[J]. Science, 2001,291(5504):657-661.

[7] 謝茂松,徐國興,李瓊,等.大鼠骨髓間充質干細胞分離培養方法的比較[J]. 國際眼科雜志, 2007,7(5):1285-1287.

[8] Tomita M, Mori T, Maruyama K, et al. A comparison of neural differentiation and retinal transplantation with bone marrow-derived cells and retinal progenitor cells[J]. Stem Cells, 2006,24(10):2270-2278.

[9] 張枝橋, 董方田, 等. 大鼠骨髓間充質干細胞體外誘導為光感受器樣細胞的研究[J]. 中華眼科雜志, 2008,44(6):540-544.

[10] Tondreau T, Lagneaux L, Dejeneffe M, et al. Bone marrow-derived mesenchymal stem cells already express specific neural proteins before any differentiation[J]. Differentiation, 2004,72(7):319-326.

[11] Deng J, Petersen BE, Steindler DA, et al. Mesenchymal stem cells spontaneously express neural proteins in culture and are neurogenic after transplantation[J]. Stem Cells, 2006,24(4):1054-1064.

中國衛生部聯合攻關課題基金(No．WKJ2005-2－013)；人事部留學回國人員優秀課題基金(No．GR-2006-FJ-1)

徐國興，zjfmuxgx@pub5.fz.fj.cn。