CD15及Ki-67表達水平與乳腺癌患者病理參數及5年存活率的關系分析

沈 玲，李海濱，羅玉群，楊 輝

據統計，我國每年約有27萬女性被確診為乳腺癌，是女性最多發的惡性腫瘤[1]。乳腺癌起源于腺上皮的異常增生，是一種血管依賴性腫瘤，在其增殖、轉移過程中需經過內皮細胞增殖、侵入、成熟、分化階段形成新的毛細血管網，是一個多基因、多因子的作用過程[2-4]。探討乳腺癌發生發展的分子機制及尋找相關特異性標志物一直是臨床研究的熱點問題[5-6]。細胞黏附分子(CAMs)是一類位于細胞表面的糖蛋白分子，與惡性腫瘤的發展相關，CD15是CAMs的配基之一[7]。Ki-67是細胞增殖的標志指標，經常用來預測惡性腫瘤患者的預后情況[8]。本研究檢測了乳腺癌腫瘤標本中CD15、Ki-67的表達情況，評估了二者與乳腺癌患者臨床病理學參數和存活率之間的關系。現報告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2014年5月—2015年5月我院收治的乳腺癌患者手術切除的石蠟標本和癌旁正常組織(距病變部位>5 cm處，且證實為無癌浸潤)石蠟標本各90例為研究對象。癌組織和癌旁組織全部取樣于女性，年齡37～68(49.64±4.09)歲；TNM分期：Ⅰ期21例，Ⅱ期50例，Ⅲ期19例；浸潤性導管癌71例，導管原位癌10例，其他類型9例。

1.2納入及排除標準

1.2.1納入標準：①參照《新編常見惡性腫瘤診治規范》[9]，由術后病理學確診為乳腺癌的患者，可以明確腫瘤大小、部位、浸潤程度；②既往未接受過乳腺癌根治術和放化療的患者。

1.2.2排除標準：治療期間死亡患者；合并其他惡性腫瘤患者；孕婦；伴隨肺間質疾病或嚴重肝腎功能障礙者；患有血液系統疾病或傳染病等。

1.3免疫組化 采用EnVision TM二步法檢測系統進行檢測。

1.3.1切片制備：4 μm厚石蠟組織切片行常規蘇木精和伊紅染色復染確認。切片經烤片、脫蠟、水化后，TBST沖洗3 min×3次。

1.3.2抗原熱修復：將切片浸泡于檸檬酸鹽熱修復液中，經高壓煮沸2 min，然后室溫放置自然冷卻。TBST沖洗一次。

1.3.3阻斷內源性過氧化物酶：甩去TBST液，每張切片滴加3% H2O2溶液，室溫下孵育10 min。甩去3% H2O2溶液，TBST沖洗3 min×3次。

1.3.4封閉非特異性結合：甩去TBST液，每張切片滴加5%BSA溶液，室溫孵育1 h。甩去5%BSA液，每張切片滴加100 μl相應的一抗∶羊抗人CD15(1∶100)單克隆抗體，兔抗人Ki-67單克隆抗體(1∶100)，將切片置于室溫下孵育1 h。甩去一抗：TBST沖洗3 min×3次。每張切片上滴加100 μl新鮮配制的DAB顯色溶液，在顯微鏡下觀察其顯色情況，顯色時間為2～3 min。自來水沖洗終止顯色，蘇木素復染3 min，1%鹽酸乙醇分化數秒，自來水沖洗返藍5 min。梯度乙醇脫水干燥、二甲苯透明后，中性樹膠封固。顯微鏡下觀察結果。以PBS代替一抗作為陰性對照，已知的CD15、Ki-67陽性標本為陽性對照。

1.4陽性判定標準 觀察高倍鏡(×400)視野下陽性細胞百分數及染色強度：陽性細胞≤5%計0分，6%～25%計1分，26%～50%計2分，51%～75%計3分，≥76%計4分；細胞未染色計0分，淡黃色為1分，棕黃為2分，棕褐為3分；總分=細胞染色評分×細胞占比評分，總分≥3分即為陽性表達[9-10]。結果評判由2人進行雙盲讀片確定。

2 結果

2.1不同組織CD15、Ki-67表達情況 乳腺癌組織CD15、Ki-67的陽性表達率分別為73.33%(66/90)、71.11%(64/90)，癌旁組織CD15、Ki-67的陽性表達率分別為25.56%(23/90)、31.11%(28/90)。乳腺癌組織中CD15、Ki-67陽性表達率均高于癌旁組織，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 乳腺癌組織中Ki-67、CD15表達情況(SP×400)

2.2CD15、Ki-67表達與乳腺癌臨床病理的關系 TNM分期Ⅱ～Ⅲ期、合并淋巴結轉移、出現神經侵犯、腫瘤直徑≥2 cm的乳腺癌患者CD15、Ki-67表達水平均較高，差異有統計學意義(P<0.05)。不同類型的乳腺癌組織Ki-67陽性表達率比較差異有統計學意義(P<0.05)；但不同年齡、腫瘤分化程度、絕經情況的乳腺癌患者腫瘤組織中CD15、Ki-67陽性表達率比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 CD15、Ki-67表達與乳腺癌患者臨床病理的關系[例(%)]

2.3乳腺癌組織中CD15、Ki-67表達相關性分析 66例CD15陽性表達的乳腺癌，Ki-67總陽性率為90.91%(60/66)、陰性率為9.10%(6/66)；經Spearman相關性分析可知，乳腺癌組織中CD15與Ki-67表達呈正相關(r=0.406，P=0.008)。

2.4CD15、Ki-67表達與乳腺癌5年生存率的關系 90例乳腺癌患者的總生存率為64.44%(58/90)。CD15、Ki-67陽性乳腺癌患者5年生存率均低于CD15、Ki-67陰性者(P<0.05)。見表2。不同CD15、Ki-67陽性表達乳腺癌患者術后5年生存率曲線見圖2。

表2 CD15、Ki-67表達與乳腺癌患者5年生存率的關系

圖2 不同CD15、Ki-67表達乳腺癌患者生存曲線

3 討論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，近年來隨著人們飲食結構和生活習慣的改變，其發病呈年輕化趨勢[11]。雖然乳腺癌的早期檢測手段和治療方法多樣，但仍有10%的早期患者未能完全治愈，對其身心健康造成了嚴重影響[12-14]。相關專家對乳腺癌的產生、發展相關的因子進行了篩選、研究，但關于乳腺癌蛋白的表達及其與臨床病理意義、中遠期預后相關性的研究報道較少。本研究采用免疫組化檢測了90例乳腺癌組織中CD15、Ki-67的表達情況，旨在從蛋白質分子水平認識乳腺癌。

Ki-67是一種與細胞增殖聯系密切的抗原，經常用于惡性腫瘤增殖能力、增殖程度的評估。賈磊等[15]回顧性分析了肝細胞癌根治手術患者的免疫組化結果，以5年是否復發作為評價標準，其研究結果顯示，CD34、Ki-67的高表達預示該類患者術后復發風險更高，提示Ki-67與腫瘤細胞的增殖能力、生長方式、轉移等多種生物學行為有聯系。除此之外，Ki-67在指導乳腺癌患者的臨床治療、藥物療效預測、預后評估方面均有較高的參考價值[16-17]。本研究中利用免疫組化法檢測腫瘤組織中Ki-67的表達情況，結果顯示，乳腺癌組織中Ki-67的陽性率顯著高于癌旁組織；同時Ki-67的陽性率與乳腺癌的TNM分期、神經侵犯、腫瘤大小、腫瘤類型、淋巴結轉移相關，提示Ki-67上調與乳腺癌細胞較強的增殖、轉移能力有關。

CD15抗原屬CAMs成員，由半乳糖、N-乙酰葡萄糖胺、巖藻糖組成，經選擇素識別后確定的CAMs配基之一，位于中性粒細胞表面。在人體正常組織中，CD15的表達并不一致，如在胃腸、肺泡、子宮黏膜上皮、乳腺導管上皮組織中的表達較高，而在食管、皮膚的鱗狀上皮組織中呈低表達，在心肌、纖維組織等非上皮組織中不表達[18-19]。戚利坤等[20]研究指出，在乳腺癌組織中CD15的陽性表達率顯著升高，且與癌的分化程度密切相關。本研究結果顯示，CD15在乳腺癌組織中的陽性表達率明顯升高，與乳腺癌的TNM分期、淋巴結轉移相關，提示CD15的表達與腫瘤細胞的增殖、分化情況相關，推測是因為乳腺癌起源于腺上皮異常增生，惡變細胞和組織中結構紊亂，影響了CD15的正常表達。

本研究分析了乳腺癌患者CD15、Ki-67的相關性，結果顯示，Ki-67的表達與CD15呈顯著正相關，提示二者可相互調控，推測是Ki-67的上調，增強細胞生長與增殖能力，進而導致惡性腫瘤中CD15表達上調，促進腫瘤細胞侵襲、轉移。同時，本研究中發現CD15、Ki-67的陽性表達的乳腺癌患者5年存活率顯著低于陰性表達患者，與既往研究結論相似[21]，說明CD15、Ki-67對乳腺癌患者中遠期的預后情況有一定的評估價值。

綜上所述，CD15、Ki-67在乳腺癌中的表達上調，與腫瘤臨床病理學指標密切相關；且二者表達呈顯著相關性。由此推測，CD15、Ki-67的高表達提示乳腺癌的惡化程度較高，轉移和侵襲能力強，中遠期預后較差。