UCF-101對蛛網膜下腔出血大鼠神經功能的保護作用

程振宇，申屠華松，陳亦華，何忠平，俞北偉，王瑞權，傅斌

（1.金華市人民醫院 神經外科，浙江 金華 321000；2.金華市食品藥品檢驗檢測研究所，浙江 金華 321000；3.金華市人民醫院 臨床醫學檢驗科，浙江 金華 321000；4.金華市人民醫院 病理科，浙江 金華 321000）

自發性蛛網膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）主要由腦動脈瘤破裂引起，預后較差[1]。除腦血管痙攣和遲發性腦缺血外，早期腦損傷是導致SAH不良預后的重要原因[2]。神經細胞凋亡是SAH后早期腦損傷的重要機制之一。SAH后加劇的神經細胞凋亡可造成患者運動和認知功能障礙，影響患者預后[3]。線粒體途徑是SAH后神經細胞凋亡的三條重要途徑之一[4]。Omi/HtrA2是一種線粒體絲氨酸蛋白酶。細胞受到刺激后，Omi/HtrA2分子被釋放到細胞質，通過增強含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase）活性參與線粒體凋亡途徑發揮致凋亡作用[5]。UCF-101是Omi/HtrA2特異性抑制劑，可明顯減少外傷性脊髓損傷、膿毒癥性腦病或腦缺血大鼠的神經細胞凋亡，顯著改善神經功能[6-9]。本研究使用UCF-101腹腔注射對SAH大鼠進行治療，旨在評價其對SAH大鼠神經細胞凋亡的抑制作用及對神經功能的改善作用，為SAH藥物治療的研究提供新思路。

1 材料和方法

1.1 材料 健康Wistar大鼠（上海斯萊克實驗動物有限責任公司），雄性，清潔級，體質量250～300 g； UCF-101（規格：5 mg/支，德國Calbiochem公司）；ApoAlert細胞凋亡檢測試劑盒（規格：100T/盒， 美國Biosciences Clontech公司）；二辛可寧酸（bicinchoninic acid，BCA）法蛋白定量試劑盒（美國Thermo Scientific公司）；脫色搖床（型號：TY-80B，常州澳華儀器有限公司）；轉印槽（型號：Trans-Blot，美國Biorad公司）；電泳儀（型號：DYCP-31C，北京六一生物科技有限公司）；小型垂直電泳槽（型號：164-8001，美國Biorad公司）；生物倒置顯微鏡[型號：IX-71，奧林巴斯（中國）有限公司]。

1.2 方法

1.2.1 分組與造模：按照隨機數字表法將90只大鼠分成Sham組、SAH組和UCF-101組，每組30只。SAH組和UCF-101組大鼠按照50 mg/kg劑量腹腔注射戊巴比妥鈉針麻醉后，采用ROUX等[10]建立的枕大池二次注血法制作SAH大鼠模型，Sham組大鼠2次均注入等量0.9%氯化鈉注射液。在手術操作前0.5 h， UCF-101組大鼠按照3.0 μmol/kg劑量給予腹腔注射UCF-101，Sham組和SAH組大鼠均按照10 mL/kg劑量腹腔注射0.9%氯化鈉注射液。在24 h后，取每組各10只大鼠，處死后取少量腦組織用于神經細胞凋亡檢測和Western blot檢測，每組剩余10只大鼠用于神經功能檢測。實驗過程中，大鼠死亡后補充成活大鼠，保證每亞組10只大鼠。

1.2.2 Western blot檢測：大鼠腦組織經細胞裂解、離心及BCA法蛋白濃度測定后，經12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉移至聚偏二氟乙烯膜上，采用5%脫脂奶粉Tris生理鹽水和吐溫20緩沖液在室溫下封閉蛋白，加入兔抗大鼠procaspase-3（1:2 000，英國Abcam公司）、procaspase-9（1:1 000，美國CST公司）、剪切聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）（1:2 000，英國Abcam公司）、caspase-3（1:2 000，英國Abcam公司）、caspase-9（1:1 000，美國CST公司）和GAPDH（1:1 000，美國CST公司）單克隆抗體孵育過夜，洗膜，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗（1:2 000，英國Abcam公司）室溫搖床孵育，洗膜，化學發光試劑作用，X光膠片曝光、沖洗并掃描。采用Quality one軟件分析雜交條帶灰度值，以GAPDH水平為內對照，比較相對灰度值。

1.2.3 細胞凋亡檢測：將大鼠腦組織進行4%多聚甲醛固定24 h后，脫水、透明、浸蠟進行包埋，作成4 μm厚度切片，60 ℃烤片3 h，切片脫蠟至水；取ApoAlert TUNEL細胞凋亡試劑盒內適量試劑 1（TdT）和試劑2（dUTP）按1:9混合，加到圈內覆蓋組織，切片平放于濕盒內，37 ℃恒溫箱孵育2 h，濕盒內加少量水保持濕度。切片用磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）洗滌3次，每次5 min；去除磷酸鹽緩沖液后在圈內滴加4，6-二脒基-2-苯基吲哚染液，避光室溫孵育10 min。玻片置于磷酸鹽緩沖液 （pH 7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5 min， 最后用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像，計算凋亡神經細胞比例。

1.2.4 認知功能測試：參照VORHEES等[11]的方法對大鼠進行Morris水迷宮定位航行實驗，在術后第1天到第3天每天3次對大鼠進行訓練，在術后第4天測定大鼠逃避潛伏期。如果大鼠在規定時間120 s 內找到平臺，記錄這個時間作為逃避潛伏期，若在120 s內找不到平臺，將其引導至平臺，讓其在平臺上站立10 s，這時逃避潛伏期記為120 s。

1.2.5 神經行為學測試：在術后第24小時，采用KAOUTZANIS等[12]的方法對大鼠進行神經行為學測定，內容包括運動反應、睜眼反應和進食3部分，分值依次為5、4和2分，總分3～11分，11分正常，3分最差。

1.3 統計學處理方法 采用SPSS19.0軟件進行統計學分析。計量資料以±s表示，3組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 UCF-101對SAH大鼠Kaoutzanis M神經行為學評分的影響 SAH組大鼠Kaoutzanis M神經行為學評分較Sham組顯著下降（P＜0.01），而UCF-101組大鼠Kaoutzanis M神經行為學評分較SAH組顯著升高（P＜0.05），見圖1。

2.2 UCF-101對SAH大鼠逃避潛伏期的影響 SAH組大鼠逃避潛伏期較Sham組顯著升高（P＜0.01），而UCF-101組大鼠逃避潛伏期較SAH組顯著下降（P＜0.01），見圖2。

2.3 UCF-101對SAH大鼠顳底皮層神經細胞凋亡相關蛋白表達的影響 SAH組大鼠顳底皮層procaspase-3、pro-caspase-9、剪切PARP、caspase-3和caspase-9蛋白表達較Sham組顯著升高（均P＜0.01），而UCF-101組大鼠顳底皮層pro-caspase-3、pro-caspase-9、剪切PARP、caspase-3和caspase-9蛋白表達較SAH組顯著下降（均P＜0.05），見圖3。

圖1 UCF-101對SAH大鼠Kaoutzanis M神經行為學評分的影響（每組n=10）

2.4 UCF-101對SAH大鼠顳底皮層神經細胞凋亡的影響 SAH組大鼠顳底皮層凋亡神經細胞比例較Sham組顯著升高（P＜0.01），而UCF-101組大鼠顳底皮層凋亡神經細胞比例較SAH組顯著下降（P＜0.01），見圖4-5。

圖2 UCF-101對SAH大鼠逃避潛伏期的影響（每組n=10）

3 討論

細胞凋亡是一種程序化的細胞死亡方式，它的一個顯著特征就是細胞染色質的DNA降解。Caspase 與真核細胞凋亡密切相關。細胞凋亡按照起始 caspase的不同，可將哺乳細胞的凋亡分為線粒體通路、內質網通路、死亡受體通路3種途徑[13]。線粒體通路是通過線粒體釋放凋亡酶激活因子激活caspase從而激活下游信號通道誘發細胞凋亡。caspase-3和caspase-9是參與細胞凋亡線粒體通路的重要信號蛋白。細胞凋亡發生時，pro-caspase-3和pro-caspase-9生成增多，同時轉化為caspase-3和caspase-9。PARP是DNA修復酶，在細胞凋亡中發揮著重要作用。PARP是caspase的切割底物。當caspase-3和caspase-9被激活時，PARP被切割成為剪切PARP，從而失去對DNA的修復功能[4]。因此，如同本研究所示，在SAH大鼠腦組織中，神經細胞凋亡加劇的同時會伴有腦組織pro-caspase-3、pro-caspase-9、剪切PARP、caspase-3和caspase-9蛋白表達水平的升高。當然，神經細胞凋亡的加劇勢必造成神經功能的破壞，這個現象在既往研究[14-15]和本研究中也得到了論證。因此，判定SAH大鼠腦組織凋亡神經細胞及pro-caspase-3、procaspase-9、剪切PARP、caspase-3和caspase-9等細胞凋亡相關蛋白的表達可評價大鼠腦組織的損傷情況，從而反映大鼠神經功能的損傷程度。

HtrA是細菌體內一種蛋白質分子，屬于絲氨酸蛋白酶家族，其含義最初是指這種蛋白質在細菌的耐熱特性中發揮重要作用，即當環境溫度正常時作為分子伴侶存在，環境溫度升高時則作為蛋白酶，參與降解細胞質內產生的異常蛋白質。隨著研究的深入，人們進一步發現其作用在于使折疊錯誤的蛋白質分子重新折疊或發生降解。在哺乳動物體內，目前觀察到的HtrA同源物有人類Omi/HtrA2[5]。Omi/HtrA2是細胞凋亡線粒體途徑中重要的信號蛋白，在內質網合成，然后由基質導入順序/線粒體定位信號引導轉運進入線粒體，在線粒體內被線粒體加工肽酶降解形成成熟的Omi/HtrA2，并儲存在線粒體膜間隙中。在病理情況下，當細胞受到刺激時線粒體膜通透性增加，Omi/HtrA2從線粒體釋放到細胞質，與X染色體連鎖凋亡抑制蛋白結合，解除了它對caspase-9的抑制，導致下游caspase-3活化，而PARP被剪切失去活性，DNA斷裂得不到修復，促成了細胞凋亡的加劇，進而引起了疾病的發生和發展[5]。在中樞神經系統，Omi/HtrA2可以促進腦損傷大鼠皮層pro-caspase-3、pro-caspase-9、剪切PARP、caspase-3和caspase-9蛋白表達量升高，破壞血腦屏障，從而加重腦水腫；這些證據說明，Omi/HtrA2可能通過促發神經細胞凋亡而參與了膿毒癥性腦病大鼠、癲癇持續狀態幼鼠和腦缺血/再灌注損傷大鼠腦損傷的發生發展過程[6-9，16-18]。

圖3 UCF-101對SAH大鼠顳底皮層神經細胞凋亡相關蛋白表達的影響

UCF-101是Omi/HtrA2特異性抑制劑，通過抑制Omi/HtrA2活性從而減少對X染色體連鎖凋亡抑制蛋白的降解，進而增強對caspase-9抑制作用，導致細胞凋亡的下降；UCF-101對心肌梗死、膿毒癥和急性腎損傷等疾病已經發揮了較好的保護作用[19]。在動物實驗階段，UCF-101多采用腹腔注射的方式來抑制各種疾病的細胞凋亡[6-9]。而UCF-101所使用的劑量變化較大。LIU等[20]發現，UCF-101劑量在 0.6～1.8 μmol/kg范圍內對心肌細胞凋亡的抑制作用呈現劑量依賴性，而1.5 μmol/kg劑量對心肌細胞凋亡的抑制作用效果最佳。在膿毒血癥腦病大鼠的研究中，UCF-101腹腔注射所使用的劑量是 10 μmol/kg[8]。而在兩個腦缺血大鼠的研究中，UCF-101腹腔注射所使用的劑量是1.5 μmol/kg[6-7]。本研究為了提高對UCF-101對SAH大鼠神經細胞凋亡的抑制作用，在腦缺血研究[6-7]的基礎上增加UCF-101腹腔注射的劑量到3 μmol/kg。本研究數據顯示，SAH組大鼠腦組織pro-caspase-3、pro-caspase-9、剪切PARP、caspase-3和caspase-9蛋白表達量、凋亡神經細胞比例和逃避潛伏期較Sham組大鼠顯著升高，而SAH組大鼠Kaoutzanis M神經行為學評分較Sham組大鼠顯著降低；而UCF-101腹腔注射均不同程度地逆轉了上述指標的變化。在腦缺血大鼠中，UCF-101腹腔注射可以顯著抑制神經細胞凋亡從而改善大鼠神經功能[6-7]。在膿毒血癥腦病大鼠中，UCF-101腹腔注射可以明顯抑制caspase-3和 caspase-9活性及神經細胞凋亡，從而改善大鼠的認知功能[8]。本研究檢測了多種細胞凋亡相關蛋白的表達，同時評價了SAH大鼠運動行為功能和認知功能，研究數據支持按照3 μmol/kg劑量腹腔注射UCF-101也可顯著抑制SAH大鼠神經細胞凋亡從而改善大鼠神經功能。由于腦組織諸多細胞可以發生凋亡，而本研究沒有采用NeuN共標染色凋亡細胞，可能導致所顯示的凋亡細胞不全是神經元細胞。但在腦組織內，神經元細胞還是占有較大比例，因此，本研究顯示的UCF-101對神經元的保護作用應該存在。當然，采用NeuN共標染色凋亡細胞對本研究的結論的嚴謹性具有較大的提升作用。綜上所述，UCF-101對SAH大鼠神經功能具有顯著保護作用，而UCF-101可能是SAH藥物治療研究的新方向。

圖4 UCF-101對SAH大鼠顳底皮層神經細胞凋亡影響的代表性TUNEL熒光染色圖（×200）

圖5 UCF-101對SAH大鼠顳底皮層神經細胞凋亡的影響（n=10）