外泌體對骨愈合作用的研究進展

王特，蔡樂益，盧迪，陳華

（溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院 創傷骨科，浙江 溫州 325027）

在社會經濟現代化發展下，創傷性骨折的發生率顯著增高，據報道由交通事故因素導致的骨折占總體因素的45%[1]。骨折不愈合是骨折臨床治療中的嚴重并發癥之一，同時也是目前研究的熱點問題。據統計有5%～10%的骨折可能發展成為骨折不愈合，從而使患者恢復功能的時間增加，造成患者經濟負擔及醫療資源的浪費[2]。此外，糖尿病性和老年性骨質疏松的增加也能導致骨微結構的破壞，顯著增加骨折風險，同時也影響骨折愈合的過程[3]。因此，如何有效地促進骨折愈合，治療骨折不愈合仍是所有骨科醫師面臨的巨大挑戰。

近年來，越來越多的研究指向具有多種生理功能的外泌體領域。外泌體由活體細胞分泌產生，其起源于晚期細胞內吞體囊泡，與細胞膜融合后往外釋放的膜性囊泡，多種細胞均能分泌，內含有特定的蛋白質、脂質、細胞因子或遺傳物質，直徑40～100 nm[4-5]。研究表明，外泌體通過介導不同細胞間的通訊參與呈遞抗原、影響腫瘤細胞生長、促進組織修復等多種病理生理學過程，能夠有效刺激機體器官、組織，包括心臟、肺臟、腎臟、骨組織、肉芽組織等的再生，在特定疾病的早期診斷、治療及精準化靶向治療等方面展現出較大的優勢[6-10]。本文將近年來外泌體在骨組織、血管骨骼肌等方面的文獻報道加以整理，以期為外泌體的基礎研究與臨床應用提供參考。

1 外泌體的基本概要

1983年，在綿羊網織紅細胞中首次發現了外泌體[11-12]，1987年JOHNSTONE等[13]將這種特異性囊泡命名為“exosome”。最初，學者認為這種膜性囊泡是一種實驗的人工成分、廢棄物或者機體壞死細胞的殘留組織[11]。直到20世紀90年代，ZITVOGEL等[14]和RAPOSO等[15]報道指出外泌體極有可能是不同細胞之間參與通訊的一種方式。

不同細胞分泌的外泌體含有特異性蛋白分子（Alix、LAMP-2、CD63、CD9、Flotillin-1等），同時還包含許多關鍵分子，發揮不同的功能[16]。通過外泌體脂質膜中具有識別作用的蛋白，能夠識別不同的靶向細胞，從而發揮生理作用，因此可以運載特定的藥物，靶向介導治療特定的疾病。然而在機體處于損傷狀態中或者外界不良的刺激等病理情況下，細胞產生的外泌體也會產生不利影響，加大損失，甚至加快疾病進程[17]。

據目前研究顯示，人類間質充干細胞分泌的外泌體參與保護心肌缺血再灌注損傷[18]，緩解肢體缺血[19]，促進創口愈合[20]，調節移植物抗宿主 病[21]，緩和腎臟損傷[22]，刺激肝臟再生[23]，抑制肺高壓[24]，促進視網膜修復[25]，參與軟骨組織[26]和骨組織再生[19]。

2 外泌體的提取與鑒定

人體體內多種細胞能夠分泌外泌體，如網織紅細胞[11]、樹突狀細胞[27]、B細胞[15]、T細胞[28]、肥大細胞[29]、上皮細胞[30]和腫瘤細胞[31]。通過運輸特定的編碼RNA[32]、非編碼RNA[33]、蛋白質[34]、抗原呈遞分子[35]和DNA[36]，外泌體參與細胞間的通訊，保護特定內容物，以調節機體不同細胞的活性。

目前，外泌體提取方法較多，方式各具特 色[37-40]。提取外泌體的方法、具體提取原理及其優缺點見表1。通常采用以下方法鑒定所提取的外泌體。第一種是電鏡下直視外泌體的形態。將提取所得的外泌體溶液滴加至100目載樣銅網上，靜置于室溫中1 min，后滴加染色劑（磷鎢酸鈉溶液或乙酸雙氧鈾溶液），染色1 min后即可觀察。第2種是免疫學方法。采用流式細胞術、Western blot、ELISA等方法檢測外泌體表面特異蛋白膜，如轉運融合蛋白、熱休克蛋白、CD9、CD63等，根據測定抗原抗體復合物上的特殊標記的量即可得知所檢測外泌體量。另外還可以采用PCR法、原子力顯微鏡、圖像流技術等[41]。目前方法較多，研究中常常會采用2～3種方法聯合測定，保證外泌體的純度。

表1 外泌體的提取方法總結

3 外泌體在成骨、破骨細胞中的作用

近年來，越來越多的學者報道了骨重建過程中外泌體發揮的作用。在骨愈合的微環境中，參與骨愈合的細胞通過分泌細胞因子調控重建過程。BEHERA等[42]研究指出，骨髓間充質干細胞通過分泌特異性外泌體，將不同的生物活性蛋白運輸至靶向細胞，從而介導骨微環境中細胞的交流，尤其是成骨細胞和破骨細胞。

CUI等[43]將礦化的前成骨細胞產生的外泌體與骨髓基質細胞共同培養，結果發現骨髓基質細胞表面出現成骨標志。通過上調Runx2、ALP的表達，發現骨髓基質細胞的礦化程度也能夠增加，因此得出外泌體介導骨髓間充質干細胞分化為成骨細胞的過程，參與機體骨重塑的機制中。同時他發現，MC3T3-E1細胞的外泌體能影響靶向細胞的miRNA，抑制Axin1表達和促進β-連環蛋白表達，進而通過Wnt促進骨髓基質細胞的成骨分化。XU等[44]也發現，C2C12肌母細胞來源的外泌體激活了Wnt/β-連環蛋白通路，促進了成骨細胞的分化。該特異性外泌體內含有miRNA等物質，其中的miR-27a-3p介導抗原呈遞 細胞的表達，成為促進成骨的主要成分。QIN等[45]研究發現，骨髓間充質干細胞分泌的外泌體含有參與成骨的miR-196a、miR-27a、miR-206，通過信號呈遞介導骨細胞的分化，指出外泌體可以促進成骨細胞分化，刺激骨組織的再生，但通過體外實驗發現對成骨細胞增殖沒有明顯影響。

SUN等[46]發現，破骨細胞能夠分泌含有特異性miRNA的外泌體，其通過調節劑miR-214介導Runx和β-連環蛋白等通路，參與成骨細胞的分化過程。LI等[47]通過人體內提取外泌體，在小鼠模型中進行了體外實驗以及基因檢測，得出了類似的結論，指出富含miR-214的外泌體不僅能夠抑制破骨細胞，也能夠促進成骨細胞的骨形成。

4 外泌體在血管和骨骼肌中的作用

在骨折的同時通常會伴隨附近血管肌肉的損傷，骨折能否順利愈合與血管的重建再生相關。大量的研究報道指出血管和骨骼肌的再生與外泌體密切相關。BIAN等[48]將間充質干細胞來源的外泌體用于急性心肌梗死大鼠模型，發現大鼠梗死的心肌血流顯著改善，梗死范圍明顯減少，表明外泌體在促血管生成活性中發揮重要作用。NAKAMURA等[49]發現，骨髓間充質干細胞分泌的外泌體中富含miR-494，通過miRNA的表達，尤其是miR-494，參與促進肌肉、血管的再生。CHOI等[50]通過小鼠實驗發現骨骼肌成肌細胞來源的外泌體含有多種信號分子，如胰島素樣生長因子、成纖維細胞生長因子-2等，通過早期與鄰近細胞融合，表現出類似于肌小管一樣的表型，增加了肌球蛋白的表達。另外，他通過體外實驗發現，骨骼肌成肌細胞來源的外泌體也能夠增加肌纖維的數量，從而顯著增加骨骼肌的再生。

目前關于外泌體及其攜帶的miRNA如何介導血管肌肉損傷的修復的具體機制及信號通路尚不明確，同時筆者也檢索了國內外多個數據庫，發現外泌體與骨骼肌損傷修復的報道較少，因此這可能能夠成為將來外泌體研究的一個方向，同時對血管骨骼肌損傷修復的治療也提供了一個新的突破口。

5 外泌體在軟骨再生中的作用

ZHANG等[26]通過在體實驗首次提出間充質干細胞來源的外泌體能夠參與骨軟骨的修補。在該研究中，間充質干細胞來源的外泌體加速了新組織填充，增強 II型膠原基質合成和硫酸化糖胺聚糖，到實驗結束時，實驗動物的軟骨成分完全恢復，與年齡匹配的對照組相類似。然而在對照組中，僅僅發現纖維性修復，并無軟骨成分。外泌體包含多種成分，類似miRNA、mRNAs、蛋白質等，這些物質極有可能參與細胞之間的通訊作用，從而發揮不同的功能，參與細胞內不同的進程。盡管參與軟骨修補特定的物質未被找到，但是外泌體確實能夠發揮參與骨組織以及軟骨組織修復重建的作用。SUN等[51]發現，相對于對照組，從高表達miR-320人骨髓間充質干細胞提取的外泌體更能夠促進關節骨軟骨細胞的增殖，下調MMP-19等，認為這種特定的外泌體或許能成為一種新的治療方案。

6 展望

目前，盡管外泌體廣泛存在，通過體內、體外實驗不難發現在一定條件下能夠參與促進軟骨細胞和成骨細胞生成，然而將外泌體作為一種治療方案，尚未見臨床研究報道，也沒有解決方案。相信在外泌體研究不斷深入的前提下，其在骨折愈合領域中的應用前景將更加廣闊。在體外可以通過細胞來源或者基因工程等方式大規模進行擴大生產，從而更加廣泛地應用于臨床。在促進骨折愈合方面，外泌體可能是一種更加有效、方便、安全的治療方案。