人和豬神經脫細胞基質蛋白質組學差異

蔣永生，張夢佩，韓春嬋，黃立江

（溫州醫科大學附屬象山醫院，浙江 寧波 315700，1.科教管理中心；2.消化內科）

外周神經損傷（peripheral nerve injury，PNI）會導致支配區域出現運動和感覺的喪失并誘發劇烈的神經疼痛，嚴重影響患者的生活質量[1]。臨床治療中，自體神經移植仍然被視為修復缺損神經的“金標準”[2]。但由于存在來源受限、獲取組織的個體差異及術后并發癥等原因，致其應用受限[3-4]。 為解決這一難題，研究人員嘗試利用去細胞后的異種組織對PNI進行修復。由于豬神經和人神經的基因序列和結構形態極為相似，故將自體神經及其制備的產品替換為去細胞后的豬神經組織并運用于PNI的修復成為目前研究的熱點[5]。本研究通過蛋白質組學分析方法，對人神經脫細胞基質（human decellularized nerve matrix，hDNM）和豬神經脫細胞基質（porcine decellularized nerve matrix， pDNM）存在的差異蛋白進行GO和Pathway分析，同時繪制2組脫細胞基質相關蛋白的熱圖，為開發豬神經生物材料并運用于PNI的臨床治療提供支撐。

1 材料和方法

1.1 材料 hDNM購自廣州中大醫療器械有限公司[商品名：神橋；批準文號：國食藥監械（準）字2012第3460641號]。pDNM委托廣州中大醫療器械有限公司生產。

1.2 方法

1.2.1 蛋白質提取：pDNM（3個樣）和hDMN（6個樣）共計9個樣品，4 ℃凍融并用預冷的PBS清洗2次，以去除樣本中殘留液體。將組織迅速置于-80 ℃ 預冷的研磨鋼管中，加入鋼珠，使用上海凈信全自動樣品快速研磨儀（型號：JXFSTPRP-32），研磨 1 min。往研磨鋼管中加入1 mL的SDS裂解液（上海碧云天，P0013G），于冰上反應30 min（每隔10 min渦旋1 min）。將研磨鋼管中的蛋白質裂解液轉移至新的EP管，170 000×g，4 ℃離心30 min，取上清液至新的EP管中并運用BCA法檢測各樣本蛋白質濃度。

1.2.2 蛋白質酶解：將各個樣品50 μg的蛋白質轉移到新試管中，加入DTT到樣品中使其終濃度為 20 mmol/L，在37 ℃中反應1 h。隨后，加入 60 mmol/L的IAA，避光于室溫進行烷基化反應 30 min。反應完成后加入6倍體積的冷丙酮， -20 ℃沉淀5 h。然后，于4 ℃中1 000×g離心收集蛋白沉淀，再用冷丙酮洗一次沉淀體。加入 20 ng/μL的胰酶25 μL，渦旋沉淀使其溶解，于 37 ℃反應過夜，最后將酶切好的多肽用C18除鹽小柱除鹽。

1.2.3 TMT標記肽段混合物：采用TMT-10Plex （Thermo Scientific，美國）標記定量試劑盒，遵照說明書進行標記。標記肽段樣品混合后凍干。

1.2.4 高pH反相分離肽段：混合物重溶于Solvent A（Solvent A：20 mmol/L甲酸銨水溶液，氨水調 節至pH 10.0）后用Ultimate 3000系統（Thermo Fisher Scientific，美國）連接反向柱（XBridge C18 column，4.6 mm×250 mm，5 μm，Waters Corporation，美國）進行高pH分離，分離使用線性梯度，40 min內5% B至45% Solvent A（B：80% ACN中加入20 mmol/L甲酸銨，氨水調節至pH 10.0）。柱子在初始條件下平衡15 min，柱流速維持在0.8 mL/min， 柱溫維持在30 ℃。收集到12個fraction，各個fraction在真空濃縮儀中干燥待用。

1.2.5 nano-HPLC-MS/MS分析：各fraction重溶于30 μL solvent C（C：0.1%甲酸水溶液）后由配備在線納噴離子源的LC-MS/MS進行分析。整套系統為串聯EASY-nano-LC的Orbitrap Fusion質譜儀 （Thermo Scientific，美國）。5 μL（1 μg）肽段樣品以4 μL/min流量上樣到捕集柱（Thermo Scientific Acclaim PepMap C18，100 μm×2 cm），隨后在分析柱（Acclaim PepMap C18，75 μm×15 cm）中以 90 min梯度分離：由7% D升至32% D，3～79 min，梯度時間76 min（D：0.1%甲酸ACN溶液）。柱流量控制在300 nL/min，電噴霧電壓2.1 kV。Orbitrap Fusion質譜儀在數據依賴采集模式下運行，自動在MS和MS/MS采集間切換，3 s一個周期。在60 K質量分辨率下獲得全掃描譜圖（m/z 350-1550），隨后在50 K分辨率下進行后續HCD MS/MS掃描，AGC target 為8e4，最大注入時間120 ms。設置為n=1后實施動態排除，時間為45 s。

1.2.6 數據處理：Protein Discoverer 2.1 SP1進行搜庫分析，使用的數據庫為人類及豬的同源肽段數據庫并構建同源肽段數據庫，其原則為：數據庫進行胰酶理論酶解，過濾所有非同源肽段，對篩選到兩個物種中100%序列匹配的特異肽段（unique peptide）進行合并得到同源肽段庫。搜庫參數如下：MS1的容差值為0.001%，二級碎片的容差值為 0.02 Da，允許的最大漏切數為2，半胱氨酸 Carbamidomethyl為固定修飾，甲硫氨酸氧化，N端乙酰化為可變修飾，蛋白鑒定控制FDR＜0.01，特異肽至少大于1。

2 結果與分析

2.1 數據質控 本研究使用pDNM組的6個樣品組和hDNM的3個樣本定量蛋白的強度數據進行主成分分析，由圖1A的結果可知，2組樣本分布在二位空間不同的區域區分明顯，說明2組樣本間存在差異。層次聚類進行樣本間的Pearson相關性系數分析（見圖1B），得出組內、組間樣本間的相關性絕大多數都達到了0.75以上，表明2組組樣本的生物學均一性較好，組內相關性很高。

圖1 試驗樣本的數據控質

2.2 差異表達蛋白鑒定結果 LC-MS/MS檢測分析了2組樣品可信蛋白1 448個，其相對含量繪制成熱圖（見圖2A），結果表明：2組蛋白都能明顯區分，組內重復性良好，表達模式存在差異，且相較于hDNM組，pDNM組整體上調。對組間差異表達蛋白進行篩選，篩選條件為：組內重復數據進行t檢驗，P＜0.05的蛋白被認為差異顯著，且蛋白豐度差異倍數達到2倍以上或者0.5倍以下。篩選結果表明，相比hDNM組，pDNM組表達上調蛋白456個，表達下調蛋白170個（見圖2B）。

圖2 pDNM和hDNM不同蛋白的定量差異

2.3 差異蛋白生物信息功能分析 對pDNM上調的456個蛋白進行GO分析，結果顯示，上調蛋白主要集中在細胞遷移、細胞骨架組織、軸突發育和神經系統發育的調節等生物過程；主要涉及生長錐、軸突、神經元胞體和突觸部分等細胞組分；參與的生物過程主要與生物功能調節、細胞骨架的結構組成、肌動活性和細胞外基質（extracellular matrix，ECM）結構協同等方面相關。KEGG通路分析顯示，2組間的差異蛋白主要介入的功能包括肌動蛋白細胞骨架的調節、軸突的引導、ECM受體相互作用和營養因子信號通路等。這些富集通路中上調和下調的蛋白數目分別為24、26、25、19和13、9、14、10。見圖3。

圖3 差異蛋白生物信息功能分析

2.4 ECM相關蛋白含量組間差異 ECM由多種蛋白質和多糖及可溶性因子組成，其中，層粘連蛋白、膠原蛋白和纖維粘連蛋白可以為細胞的生長創造良好的微環境，進而促進神經纖維的再生和神經功能的修復[6]。糖胺聚糖（glycosaminoglycans，GAGs）和肝素帶有大量負電荷，易與各類生長因子相結合進而調控細胞的生長行為和特定的生物學過程[7]。由蛋白質組學定量的結果可知，上述ECM相關蛋白在組內含量較為一致，組間差異較為顯著。與hDNM組相比，pDNM含有更多的粘連蛋白、膠原蛋白和纖維粘連蛋白，但GAGs和肝素的含量較少（見圖4）。

圖4 組間ECM相關蛋白表達差異熱圖

3 討論

在臨床實踐中，將捐獻者的神經脫細胞后，再與患者斷裂的神經進行橋接被認為是修復周圍神經缺損的策略之一，將該去細胞同種異體神經開發成臨床治療PNI的產品包括神橋和Avance?[8-9]。然而，人的脫細胞神經不能廣泛運用于PNI的修復，受限的原因主要包括[10]：①來源有限。獲取的途徑主要通過志愿者的捐贈，數量較少。②質量層次不齊。捐贈的神經來源于不同年齡、不同健康程度的人群，且存放時間不同，導致供體神經的質量無法保證。③術后并發癥。存在移植后供體神經與配體神經大小不匹配、手術過程中的技術差異等原因導致的術后神經疼痛、神經腫瘤甚至無顯著功能恢復的情況。

為解決上述問題，科研人員已經將研究的重點轉移到豬組織材料產品的開發上。因為豬和人的基因序列極為相似，利用豬的心臟器官制備的水凝膠（臨床批準號：NCT 0230562）可通過重塑缺血心臟內部的微環境進而促進心肌細胞的浸潤與生存，達到預防和（或）治療心肌梗死的目的[11]。另外，在解剖學中，豬神經的構造和形態與人神經較為類似，且在農業高度發達的今天，家豬的飼養已成規模化和商業化，故豬神經的來源較為廣泛且價格適 宜[5]。因此，豬神經組織產品的開發為人類PNI的修復提供了一條有吸引力的可替代途徑[12-13]。已有研究報道，可成功制備豬的脫細胞神經，并檢測出內部DNA的含量較低且保留主要的ECM相關蛋白（包括膠原、層粘連蛋白和纖維連接蛋白）[14]。KVIST等[15]利用豬神經（異種）和鼠神經（異體）分別移植入大鼠10 mm缺損坐骨神經的兩端并進行10 d 的修復，發現二者均可有效地促進軸突的生長和髓鞘相關蛋白的表達。

盡管豬神經組織運用于PNI的修復存在一定的前景，但該組織的直接運用可能無法達到修復損傷神經的目的，因為豬神經含有引起免疫排斥反應的生物大分子，包括a（1，3）-半乳糖[α（1，3）-galactose，α-gal]和主要組織相容性復合物I （majorhistocompatibility complex class I，MHC I），以及一些內毒素[16]。這些物質必須盡量地去除以保證移植體內后的生物安全。脫細胞技術可通過化學和物理的方法去除神經組織中的細胞，形成無免疫原性或低免疫原性的神經材料。因此，在修復PNI的臨床運用中，需要對豬神經組織的原材料進行脫細胞化。已有研究報道稱，將pDNM制備成生物水凝膠涂抹在納米纖維的表面可促進施旺細胞（Schwann cells，SCs）的遷移和軸突的再髓鞘化[17]。也有研究證實，將該生物水凝膠灌注于神經導管的表面可顯著提高外周神經缺損動物神經纖維的再生和功能的恢復[18]。這些研究結果表明，利用豬神經制備的生物材料對外周神經的保護和再生療效顯著。但是在脫細胞的過程中，除去免疫原性物質的同時，一些神經組織內部含有的ECM蛋白，比如層粘連蛋白、膠原蛋白和纖維粘連蛋白，也不可避免地被去除[7]，而這類物質可營養細胞并為神經的再生創造良好的微環境。因此，對脫細胞后的基質內部各類蛋白的有無和含量進行檢測對評價該類產品的質量和有效性至關重要。

本研究采用TMT標記定量蛋白質譜技術，對pDNM和hDNM含有的各類蛋白進行定量并進行差異化分析，結果發現，pDNM選取的3個樣本和hDNM選取的6個樣本均呈現組內均一性和重復性良好、組間差異性顯著的特征，且pDNM內部含有的各類蛋白的量整體多于hDNM。造成這種結果的原因包括：①豬神經本身具有的蛋白含量高于人神經；②由于在脫細胞過程中，人神經比豬神經更加容易除去自身的各類蛋白，導致pDNM含有的各類蛋白含量高于hDNM。故選擇適宜的脫細胞方法和試劑，盡可能地除去組織器官內的免疫原性大分子，并盡量保留能促進細胞生長和組織發育的結構和功能蛋白，對脫細胞產品的醫學運用至關重要。

本研究利用生物信息學對差異蛋白進行GO富集化和KEGG通路分析，結果顯示，上調的pDNM蛋白主要富集于生長錐、軸突、神經元胞體和突觸部分，并調控細胞遷移、神經系統和軸突的發育等生物功能，說明pDNM富含的相關蛋白可能對損傷神經的再生和修復具有重要的影響。KEGG通路分析顯示，差異蛋白主要介入的功能包括肌動蛋白細胞骨架的調節和軸突引導等方面，且pDNM上調的蛋白數更多，進一步驗證上述推論。本研究對為細胞生長提供良好微環境并營養神經和促進其發育的一類ECM相關蛋白在pDNM和hDNM的表達進行了整理并繪制熱圖，結果發現，雖然pDNM含有的GAGs和肝素含量不及hDNM，但對于粘連蛋白、膠原蛋白和纖維粘連蛋白這些主要的ECM蛋白在pDNM的含量更高，可能這些ECM蛋白的豐富存留是豬神經去細胞材料具有優越修復PNI的重要緣由。

綜上，pDNM含有的各類蛋白的量總體高于hDNM， 且具有促進細胞生長和組織發育的ECM相關蛋白在pDNM富含更多。基于此，我們的研究可以為豬神經去細胞材料替代人神經去細胞產品提供更多地數據支持。