抗弓形蟲伴侶蛋白60多克隆抗體制備與鑒定

曹佳欣，程琳妍，劉淑賢，譚峰

（溫州醫科大學，浙江 溫州 325035，1.眼視光學院 生物醫學工程學院；2.第一臨床醫學院；3.基礎醫學院）

剛地弓形蟲（Toxoplasma gondii）是一種機會性致病原蟲，可寄生于人和哺乳動物、鳥類、爬行類等動物的有核細胞內。據評估，全球約1/3人口血清弓形蟲抗體呈陽性[1]，所致的弓形蟲病是一種重要的人畜共患疾病。當宿主免疫力下降時，弓形蟲常可引起弓形蟲腦炎、弓形蟲眼病等，嚴重時可致死亡[2]。尋找合適的弓形蟲防治藥物靶點對于弓形蟲病的防治具有重要意義。

頂質體是大多數頂復門寄生蟲（包括弓形蟲）中一個獨特的、葉綠體樣細胞器，對于蟲體發育具有極其重要的作用，能夠為蟲體脂肪酸、類異戊二烯和血紅素等生物合成提供重要場所[3]。由于頂質體不存在于其他哺乳動物細胞中，因而被認為是特異性抑制或殺滅弓形蟲的理想靶點[4]。與其他質體相似，絕大多數頂質體蛋白為核編碼蛋白[5-6]，分別為包含有經典的靶向肽序列蛋白和缺失經典的靶向肽序列蛋白[7]。弓形蟲頂質體基質蛋白Cpn60蛋白（TgCpn60）屬于前者。

Cpn60為第I類伴侶蛋白，因其大小為60 kDa，一般稱為Chaperonin60。目前已經發現的有兩類伴侶蛋白，第I類伴侶蛋白最常見，廣泛存在于原核和真核生物中的寡聚蛋白復合體，如存在于細菌（GroEL）、 質體（Cpn60）和線粒體（Hsp60）。細菌伴侶蛋白[8-9]和線粒體伴侶蛋白[10-11]已有較深入的研究，在高等植物中，Cpn60被證實具有幫助蛋白完成折疊裝配的功能[12]。而在頂復門寄生蟲中，Cpn60的生物學功能及作用機制尚未明確。據此，我們在弓形蟲數據庫ToxoDB中找到弓形蟲伴侶蛋白TgCpn60的編碼基因，通過原核表達TgCpn60蛋白，制備其特異性多克隆抗體，為研究該蛋白生物學功能、觀察頂質體內穩態提供實驗材料。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質粒、蟲株及實驗動物：原核表達載體pGEX-4T-1、大腸埃希菌（E.coli）TOP10和BL21感受態細胞、人包皮成纖維細胞（human foreskin fibroblasts，HFF）、弓形蟲RH株速殖子均為本實驗室保存。pFNR-RFP質粒為法國國家科學研究中心Sébastien Besteiro教授饋贈。BALB/c小鼠購自溫州醫科大學實驗動物中心，實驗動物許可證號：SYXK（浙）2015-0009。

1.1.2 PCR引物設計與合成：①巢式PCR引物：根據ToxoDB中TgCpn60基因編碼序列（TGGT1_ 240600）， 并針對編碼該蛋白C末端168個氨基酸殘基的507 bp 基因序列設計兩對引物：TgCpn60-P1：5’-TGATCGG TGCGTCGACAGAAAC-3’；TgCpn60-P2：5’-ACGGTAAGCGG CAAGTTAGGTAGAG-3’；TgCpn60-P3：5’-CGGGATCCCTCGA AACTGGCTACGTTCCCG-3’；TgCpn60-P4：5’-CCGCTCGAGT CATGCCATTGGCATGTCTGGTAC-3’（下劃線部分分別為限制性內切酶BamHI和XhoI的酶切位點）。②重組質粒鑒定PCR引物：根據載體pGEX-4T-1序列設計以下通用測序引物：TgCpn60-F：5’-GACCCAATGTGCCTGG AT-3’；TgCpn60-R：5’-CCGGCATCCGCTTACAGA-3’，引物均由北京六合華大基因科技有限公司合成。

1.1.3 主要試劑：反轉錄試劑盒HiScript?II 1st Srand cDNA Synthesis Kit購自南京諾唯贊生物科技有限公司；KAPA HiFi HotStart ReadyMix PCR Kit購自美國KAPA Biosystems公司；4×蛋白上樣緩沖液購自美國Invitrogen公司；DNA凝膠回收試劑盒購自美國Axygen公司；質粒提取試劑盒購自美國OMEGA Bio-tek公司；限制性內切酶BamHI、XhoI、T4DNA連接酶購自美國Thermo Fisher Scientific 公司；GoTaqTMGreen Master Mix購自美國Promega公司；IPTG購自美國Sigma公司；蛋白酶抑制劑購自瑞士Roche生物公司；蛋白純化Glutathione-SepharoseTM4B購自德國QIAGEN公司；Protein A親和介質購自美國Thermo Fisher Scientific公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG抗體購自合肥Biosharp生物科技公司；Dlight 488山羊抗鼠IgG抗體購自美國EarthOx Life Science公司；0.22 μm PVDF轉移膜購自美國Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 巢式PCR擴增目的片段：弓形蟲RH株速殖子常規培養，待蟲株完全出胞，將蟲體懸液經3 μm濾膜過濾后離心收集蟲體。以TRIzol法提取蟲體總RNA并反轉錄合成cDNA，以cDNA為模板，PCR擴增編碼該TgCpn60蛋白C末端的507 bp編碼基因，第一輪PCR反應體系為：cDNA模板0.5 μL，TgCpn60-P1、TgCpn60-P2引物（10 μmol/L）各0.5 μL，10×Buffer for KOD Plus 2.5 μL，dNTPs（2 mmol/L each） 2 μL，MgSO4（25 mmol/L）1 μL，KOD Plus 0.5 μL， 加ddH2O至25 μL。反應條件為：94 ℃預變性5 min， 94 ℃變性30 s、58 ℃退火30 s、68 ℃延伸75 s，共15個循環，68 ℃再延伸10 min；第二輪PCR反應體系為：第一輪PCR產物1.5 μL，TgCpn60-P3、TgCpn60-P4引物（10 μmol/L）各1 μL，10×Buffer for KOD Plus 5 μL，dNTPs（2 mmol/L each） 4 μL，MgSO4（25 mmol/L）2 μL，KOD Plus 1 μL，加ddH2O至50 μL。反應條件為：94 ℃預變性5 min， 94 ℃變性30 s、59 ℃退火30 s、68 ℃延伸1 min， 共3個循環，94 ℃變性30 s、66 ℃退火30 s、68 ℃ 延伸1 min，共30個循環，68 ℃再延伸10 min。

1.2.2 原核表達質粒pGEX-4T-1-TgCpn60C168AA的構建和鑒定：限制性內切酶BamHI、XhoI分別雙酶切TgCpn60C168AA的PCR產物和pGEX-4T-1質粒，37 ℃酶切3 h。2%瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產物，用膠回收試劑盒進行回收，T4DNA連接酶將目的基因和載體酶切回收產物于16 ℃連接過夜。連接產物利用熱激法轉化入感受態TOP10，涂板氨芐抗性平板，37 ℃ 倒置培養過夜，挑取單菌落利用引物TgCpn60-F和TgCpn60-R進行菌液PCR鑒定，反應體系為：GoTaqTMGreen Master Mix酶10 μL，TgCpn60-F、TgCpn60-R 引物（10 μmol/L）各1 μL，菌液2 μL，加ddH2O至20 μL。反應條件為：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s、56 ℃退火30 s、72 ℃延伸2 min，共25個循環，72 ℃再延伸5 min。陽性菌落擴大培養后送北京華大基因科技有限公司測序驗證。

1.2.3 重組蛋白GST-TgCpn60C168AA的誘導表達、純化和鑒定：將測序正確的重組質粒pGEX-4T-1-TgCpn60C168AA熱激法轉化入BL21感受態細胞，挑取單克隆菌落，加入IPTG至終濃度1.0 mmol/L，于37 ℃常規誘導培養6 h。將誘導后產物離心收集菌體，沉淀超聲裂解后4 ℃、12 000 r/min離心，Glutathione-SepharoseTM4B介質純化上清液中的GST-TgCpn60C168AA重組蛋白，常規SDS-PAGE電泳分析TgCpn60蛋白表達情況。

1.2.4 抗體制備：取純化后的GST-TgCpn60C168AA融合蛋白適量加入等體積的弗氏完全佐劑充分混勻后背部皮下多點注射免疫5只BALB/c小鼠，1 mg/只。之后每隔15 d，0.5 mg/只抗原加等體積的弗氏不完全佐劑加強免疫1次，共3次。

1.2.5 抗體效價及特異性鑒定：免疫結束后，采集鼠血清，將免疫鼠血清以起始濃度為1:1 000進行3倍梯度稀釋，濃度分別為1:1 000、1:3 000、1:9 000、1:27 000、1:81 000、1:243 000，稀釋后的鼠血清作為一抗，以免疫前鼠血清（1:1 000）作為對照，以GST-TgCpn60C168AA蛋白包被酶標板進行間接ELISA評價免疫后小鼠血清抗體效價。將ELISA檢測效價最高的小鼠血清混合，用平衡緩沖液稀釋到2 mL，然后用0.5 mL的Protein A填料進行親和純化。洗脫的目的蛋白用PBS（pH7.4）透析兩次后，使用截流量為10 kDa的超濾管濃縮后分裝保存于-80 ℃。分別取純化前蛋白、穿透液、洗雜液和洗脫液進行SDS-PAGE電泳以評價純化效果。

1.2.6 多抗識別弓形蟲內源性TgCpn60：提取蟲體總蛋白行SDS-PAGE電泳后，分別以免疫前鼠血清和制備的鼠抗TgCpn60C168AA多克隆抗體（1:1 000）作為一抗，羊抗鼠HRP-IgG（1:5 000）作為二抗，Western blot檢測抗體特異性。以重組GST-TgCpn60C168AA蛋白為陽性對照，HFF細胞總蛋白為陰性對照。

1.2.7 間接免疫熒光法（indirect immunofluorescence，IFA）檢測TgCpn60蛋白與 TgFNR蛋白共定位情況：將純化好的50 μg pFNRRFP質粒電轉入弓形蟲RH株，電轉條件為：電壓1 700 V、脈沖時程176 μs、脈沖次數2次、脈沖間隔100 ms。電轉72 h后進行IFA試驗，常規固定、透化、封閉蟲體，分別以免疫前鼠血清和制備的鼠抗TgCpn60C168AA多克隆抗體作為一抗、Dlight 488山羊抗鼠IgG抗體作為二抗。染色結束后進行DAPI核染、封片。玻片置于熒光顯微鏡下觀察、拍照。

2 結果

2.1 目的基因的PCR擴增結果 TgCpn60C168AA編碼基因的目的片段理論大小為507 bp，巢式PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳后，在約507 bp處可見一條清晰的特異性擴增條帶，與理論大小一致（見圖1）。

2.2 重組質粒pGEX-4T-1-TgCpn60C168AA的鑒定 采用載體上的通用引物（包含靶基因在內的全片段長度為806 bp）對重組質粒pGEX-4T-1-TgCpn60C168AA進行PCR鑒定。電泳結果表明，所挑取的5個單克隆菌落的目的基因片段均約為806 bp（見圖2）。測序驗證，結果表明：該質粒含有一個507 bp、與TgCpn60C168AA編碼序列完全一致的片段序列，證實pGEX-4T-1-TgCpn60C168AA重組質粒構建成功。

圖1 弓形蟲TgCpn60C168AA編碼基因PCR產物

圖2 重組質粒pGEX-4T-1-TgCpn60C168AA鑒定結果

2.3 GST-TgCpn60C168AA融合蛋白的表達、純化和鑒定 TgCpn60C168AA蛋白預期大小約17 kDa，而GST標簽蛋白約24 kDa，因此GST-TgCpn60C168AA融合蛋白的全長約為41 kDa。將鑒定正確的重組質粒pGEX-4T-1-TgCpn60C168AA轉化至BL21表達菌中，以IPTG誘導表達后，經Glutathione-SepharoseTM4B介質純化，SDS-PAGE檢測可見大量目的蛋白，其蛋白大小符合預期（見圖3），純化后蛋白濃度為16.8 mg/mL。

2.4 鼠抗GST-TgCpn60C168AA多克隆抗體純化 經免疫后，以免疫前鼠血清為對照，ELISA法測定5只免疫鼠抗GST-TgCpn60C168AA血清效價，其中4只鼠血清抗體效價達到1:81 000。將這4只鼠血清收集后經親和層析純化，SDS-PAGE檢測顯示，純化后的多克隆抗體純度在90%以上（見圖4）。

2.5 評價鼠抗GST-TgCpn60C168AA多抗識別弓形蟲內源性TgCpn60的能力 提取弓形蟲全蟲蛋白行Western blot檢測，以免疫前鼠血清作為一抗發現血清不能識別弓形蟲內源性TgCpn60，而鼠抗GST-TgCpn60C168AA多克隆抗體與弓形蟲全蟲蛋白在 40、60 kDa附近分別出現反應帶，宿主細胞組作為陰性對照，與鼠抗TgCpn60無特異性結合（見圖5）。

圖3 GST-TgCpn60C168AA融合蛋白SDS-PAGE鑒定結果

圖4 SDS-PAGE鑒定純化后鼠抗GST-TgCpn60C168AA多克隆抗體

圖5 Western blot分別檢測免疫前鼠血清（左）和抗GST-TgCpn60C168AA多抗（右）與內源性TgCpn60反應

2.6 IFA檢測TgCpn60蛋白與TgFNR蛋白共定位情況 將pFNR-RFP質粒瞬時轉染弓形蟲后，分別以免疫前鼠血清和鼠抗GST-TgCpn60C168AA多克隆抗體為一抗進行IFA檢測，結果顯示，免疫前鼠血清不能識別蟲體內源性TgCpn60蛋白，而制備的多克隆抗體可以識別蟲體內兩種形式的TgCpn60蛋白，并且TgCpn60成熟蛋白與TgFNR（頂質體外腔膜標志物）存在共定位情況（見圖6）。

圖6 TgCpn60與TgFNR共定位IFA實驗結果（箭頭所指為共定位位置）

3 討論

弓形蟲蟲體在分裂過程中，親代蟲體的頂質體會附著在中心體上，隨著細胞核分裂而分離，使得每個子代蟲體都含有一個頂質體[13]，若干擾此過程，蟲體會出現遲發型死亡表型[14]。雖然頂質體具有獨立、可自主復制的基因組[15]，但絕大多數頂質體蛋白仍由核基因編碼，核編碼蛋白如何定位于頂質體以及如何輸入至頂質體四層膜結構尚未明確。TgCpn60蛋白已經被證實是定位于頂質體基質腔的核編碼蛋白[16]，是研究核編碼蛋白如何輸入至頂質體的理想靶標。

TgCpn60蛋白屬于含有經典的靶向肽序列蛋白，該類蛋白的N端含有一個由信號肽和轉運肽組成的靶向肽。在胞漿合成前體蛋白后，信號肽驅動前體蛋白進入內質網加工，導致信號肽被切除，從而暴露轉運肽，后者即可將前體蛋白轉運至頂質 體[17-18]，轉運肽被切除，前體蛋白成為成熟蛋白發揮功能[19]。由于TgCpn60蛋白N端具有靶向肽，其N端表達的蛋白不適于作為免疫原，因此本研究誘導表達了TgCpn60蛋白C末端的168個氨基酸殘基，以此作為免疫原免疫BALB/c小鼠，獲得了相應的鼠多克隆抗體，說明該片段具有強抗原性。再利用純化后的多克隆抗體進行Western blot檢測，發現其可識別內源性TgCpn60蛋白且具有兩條明顯的反應條帶，表明我們制備的多克隆抗體能夠特異性識別TgCpn60蛋白的前體蛋白和成熟蛋白兩種形式。

NADP+鐵氧化還原蛋白還原酶（ferredoxin-NADP+reductase，FNR）廣泛存在于三大類生命形式：真核生物、細菌和古生菌。Fd/FNR電子傳遞系統參與了多種關鍵的代謝過程，從光合作用和能量代謝到各種生物合成反應[20]。含有頂質體的頂復門原蟲同樣擁有Fd和FNR兩種蛋白，兩者均定位于頂質體中[21-23]。與TgCpn60相同，核編碼的TgFNR蛋白因其N端具有一個頂質體轉導肽，這段轉導肽可介導TgFNR轉運入頂質體外腔膜，因而被認為是頂質體的標志蛋白[24-25]。該蛋白雖然可以指示頂質體的位置，由于定位于頂質體外腔膜，無法反映頂質體基質的形態及大小變化，因此，為更精確地觀察頂質體基質動態變化，本研究制備了TgCpn60抗體。為了進一步明確本研究制備的多克隆抗體可以識別蟲體內的天然TgCpn60，我們以TgFNR蛋白為參照，通過瞬時電轉pFNR-RFP質粒至蟲體內，并利用IFA技術檢測TgCpn60蛋白與TgFNR蛋白共定位情況，發現兩種蛋白存在共定位現象，且與TgFNR蛋白發生共定位的為轉運至頂質體的TgCpn60蛋白，即TgCpn60成熟蛋白，而TgCpn60前體蛋白未進入頂質體，因此與TgFNR蛋白無共定位現象，兩種形式的TgCpn60蛋白都能夠被TgCpn60抗體所識別，該實驗結果同樣證實本研究成功制備了鼠抗TgCpn60多克隆抗體。

質體Cpn60同源物在多物種中的作用舉足輕重，具有多種生物學功能[8-11]。TgCpn60蛋白定位于頂質體基質腔，推測其在頂質體穩態中可能具有重要功能，該蛋白的其他生物學功能有待進一步研究。本實驗獲得的可識別弓形蟲內源性TgCpn60蛋白的多克隆抗體，可作為頂質體基質的指示劑，用于評價、觀察頂質體在世代遺傳過程中的形態變化，同時該抗體的獲得可為進一步研究TgCpn60生物學功能提供必要的實驗材料，也將有助于完善核編碼蛋白輸入頂質體途徑。