溫度對海水青鳉胚胎發育的影響

劉凱凱，袁廷柱，唐君瑋，宋靜靜，劉洪軍，遲雯丹，蓋珊珊，于道德*

(1.山東省海洋生物研究院，山東省海水健康養殖技術工程技術研究中心，青島市海洋生物種質資源挖掘與利用工程實驗室，山東青島266104;2.長島海洋生態文明綜合試驗區海洋經濟促進中心，山東煙臺265800)

海水青鳉Oryzias melastigma隸屬于輻鰭亞綱Actinopterygii鳉形目Cypernodontiformes青鳉屬，原產于印度、巴基斯坦、緬甸和泰國沿海及淡水水域(Dong et al.，2014)。海水青鳉是小型的熱帶魚種，全年產卵，具有性別易區分、產卵率高、世代周期短、鹽度適應范圍廣等特點，已逐漸成為一種理想的海洋模式魚種 (Kong et al.，2008;Chen et al.，2009;Dong et al.，2014)。由于對水質和環境中各種污染物干預敏感，海水青鳉已被廣泛應用于海洋生態毒理學研究(Bao et al.，2011;穆景利等，2011;Tian et al.，2011)，被國際生命科學學會健康和環境科學研究所(HESI)認定為毒理學研究的重要工具(伍辛瀧等，2012)。

環境因子對于魚類的生長發育、攝食、繁殖等起著重要作用。魚類的生長發育易受溫度、pH、溶解氧、鹽度及光照強度等外界環境因素的影響。其中，溫度是影響魚類生存、生長的重要環境因子，影響魚類胚胎發育時間、卵黃利用率、孵化后仔魚的大小以及關鍵組織和結構的形成與功能(Kamler，1992;Saka et al.，2004;Gabillard et al.，2005)。不同魚類對溫度的適應范圍有很大差異，同種魚類的不同生態類群，其適溫范圍亦可能不同。確定魚類胚胎發育的適宜溫度范圍，是進行人工繁育的關鍵。有關溫度對魚類胚胎發育影響的研究，國內外已有很多報道(Petereit et al.，2008;柴學軍等，2011;Guillen et al.，2014)，然而，不同溫度下海水青鳉胚胎發育的相關研究尚處于空白。本文研究了溫度對海水青鳉胚胎發育的影響，旨在探索海水青鳉胚胎發育的最佳溫度范圍，以期為海水青鳉的基礎生物學積累資料，并為提高孵化率提供數據參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選取實驗室世代培養的3月齡性成熟海水青鳉(10雌×10雄)作為親魚，暫養于玻璃缸中，體長28 mm±2 mm。每天定時投喂2次初孵鹵蟲的無節幼體。實驗用水為青島沙子口過濾海水，溫度為27℃ ±1℃，鹽度為32‰，光照周期為14 h∶10 h(光照∶黑暗)。親魚產卵受精后，用塑料吸管小心地將受精卵從玻璃缸底部吸出，放入盛滿海水的培養皿中，通過解剖鏡觀察挑選出發育正常且處于同一發育時期的受精卵(囊胚期)用于溫度試驗。

1.2 試驗方法

試驗設置19℃、22℃、25℃、28℃、31℃和34℃共6個溫度梯度。試驗容器為200 mL燒杯，實驗用水為紅海鹽(Israel)與超純水配制而成的人工海水，鹽度27‰。每個溫度組設置2個平行，每個燒杯放入30粒挑選好的受精卵。將試驗容器放入玻璃缸中，使用恒溫加熱棒控制水溫，每天3次記錄水體實際溫度，計算平均值。采取逐漸升降溫的方法，以每小時升(降)0.5℃的速度逐漸升(降)溫度，達到預定溫度后恒溫孵化。每天使用等溫水體換水1/3，保證受精卵孵化水體的新鮮。

定期使用奧林巴斯SZ61解剖鏡觀察受精卵的發育情況，并使用Zeiss Stereo Discovery V12體視顯微鏡拍照記錄。在仔魚半數出膜時計算孵化時間，仔魚全部出膜后計算孵化率和畸形率，畸形主要指卵黃囊水腫和脊柱彎曲，結果取2組平行數據的平均值。

1.3 數據處理

使用SPSS 17.0和Excel 2016處理數據、制作圖表并對變化趨勢作相應回歸分析。生物學零度(C)與有效積溫(K)是研究魚類胚胎發育的指標，對人工育苗生產有重要的參考價值。胚胎發育速度的溫度系數(Q10)可以定量表示某一溫度范圍內溫度變化對胚胎發育速度的影響。生物學零度、有效積溫和溫度系數按以下公式計算:

式中，t為胚胎完成發育所需要的時間，V為胚胎發育所需時間的倒數(1/t)，n為試驗設計的溫度梯度的個數，T表示胚胎發育的平均溫度。

式中，T0表示胚胎發育的起始溫度，t0表示孵化溫度為T0時的孵化時間，ta表示孵化溫度為Ta時的孵化時間。

2 實驗結果

2.1 溫度與胚胎孵化時間的關系

海水青鳉的孵化時間隨孵化溫度升高而縮短。水溫為19.8℃時，孵化時間為33.4 d，水溫為33.8℃時，孵化時間僅為8.5 d。在試驗溫度范圍內，孵化時間(y)與孵化溫度(x)呈負相關:y=0.147 4x2－9.445 1x+160.4，R2=0.933 6(P ＜0.01)(圖1)。

圖1 海水青鳉Oryzias melastigma孵化時間與孵化溫度的關系Fig.1 Relationship between hatching time and hatching temperature of Oryzias melastigma

2.2 溫度對胚胎孵化率和畸形率的影響

19.8 ～33.8℃都可孵化出仔魚。其中，27.6℃的孵化率最高，為63.33%，而19.8℃和33.8℃的孵化率較低，分別為10%和33.33%。在試驗溫度范圍內，孵化率(y)隨著孵化溫度(x)的升高，呈現先升高后降低的趨勢(圖2)，其關系大致符合 y= －0.725 6x2+40.192x－500.2，R2=0.886 6(P＜0.01)。在解剖鏡下觀察發現，28.0℃時胚胎畸形率最低(圖3)。孵化的正常仔魚形態特征正常、活力旺盛(圖3:a);19.8℃孵化的部分仔魚身體消瘦，脊椎彎曲呈V形(圖3:b);33.8℃孵化的部分仔魚卵黃囊出現水腫(圖3:c);30.5℃魚卵更易粘附臟污，滋生霉菌(圖3:d);仔魚通過尾部破膜的形式出卵(圖3:e)。

圖2 海水青鳉孵化率、畸形率與孵化溫度的關系Fig.2 Relationship between hatching temperature and hatching rate and deformity rate of Oryzias melastigma

圖3 孵化溫度對海水青鳉初孵仔魚發育的影響Fig.3 Effects of hatching temperature on the development of newly-hatched larvae of Oryzias melastigma

2.3 胚胎發育的有效積溫與生物學零度

試驗結果顯示，海水青鳉胚胎發育的生物學零度和平均有效積溫分別為14.89℃和3 919.04℃·h(表1)。

表1 不同孵化溫度下海水青鳉胚胎發育的有效積溫Table 1 The effective accumulative temperature degree of Oryzias melastigma embryos at different temperatures

2.4 溫度系數

不同孵化溫度范圍內海水青鳉胚胎發育速度的溫度系數顯示，海水青鳉在溫度22.5～33.8℃的 Q10接近2(2.04)(表2)。

3 討論

魚類的胚胎發育容易受到外界環境因素的影響，其中溫度的影響最大(Korwin-Kossakowski，2012)。本研究發現海水青鳉胚胎發育過程對溫度比較敏感，孵化溫度過高或過低會加速或抑制胚胎發育進程。在19.8～33.8℃溫度范圍內，海水青鳉都能孵化出膜，且隨孵化溫度的升高，孵化歷時逐漸縮短。李岑等(2011)、Ahn等(2012)和黃賢克等(2017)分別研究了溫度與泰國斗魚Betta splendens、日本鰻鱺 Anguilla japonica和黃姑魚Nibea albiflora胚胎發育的關系，發現胚胎發育時間與溫度呈負相關，本研究結果與上述結果一致。

表2 海水青鳉胚胎在不同孵化溫度范圍的溫度系數Table 2 Q10of embryonic development of Oryzias melastigma at different temperatures

魚類胚胎的孵化出膜主要靠胚體的運動和孵化酶的作用(肖楓，康懷彬，2007)。溫度主要通過影響孵化酶的分泌及其活性而控制仔魚的孵出，同時影響胚胎的孵化率和孵化進程(樊廷俊，史振平，2002)。在33.8℃下，海水青鳉胚胎的孵化時間僅為8.5 d。可以推測，孵化溫度升高可能提高了孵化酶的活性，代謝過程比低溫時發生得更快，使得卵內胚胎的發育比低溫時更活躍，從而加速了孵化進程。而在19.8℃下，海水青鳉孵化時間為33.4 d，為33.8℃下孵化時長的3.9倍。解剖鏡下觀察發現，胚胎心跳和血流速度遲緩，發育速度緩慢。低溫環境降低了胚胎發育過程中孵化酶的活性，魚卵內的新陳代謝活動受到抑制，卵黃的消耗速度降低，最終導致孵化時間延長。

升高孵化溫度雖然可以加速孵化，但對魚類的生長發育并非一定有利。高溫可能具有致畸作用或引起肌肉細胞的長期改變(Finn，2007)。本實驗中，孵化溫度升高，初孵仔魚出現卵黃囊水腫，畸形率增加。卵黃囊是仔魚逐步從內源性營養階段轉入外源性營養階段的重要營養物質來源(殷名稱，1995)。魚類卵黃囊的消耗速度取決于周圍水溫(Petereit et al.，2008)。高溫下初孵仔魚孵化歷時短，能夠提前進入外源性營養階段，消耗的營養物質較少，導致卵黃囊體積較大。同樣，溫度降低，初孵仔魚畸形率也會增加，其表現為身體消瘦、脊椎彎曲。

溫度升高還會影響魚卵表面細菌和真菌的生長(Cook et al.，2005)。海水青鳉魚卵為沉性卵，表面附有短絨毛和長纖維絲，具有黏性(王友紅等，2017)。本研究發現，與其他試驗溫度相比，在30.5℃下，魚卵表面更容易吸附臟污，推測此溫度可能適宜某種霉菌的生長。海水青鳉通過尾部擺動破膜出卵，此胚胎觀察結果與陳漪等(2016)的結果一致。仔魚尾部破膜后，頭部何時出卵取決于仔魚的力量和活力(Korwin-Kossakowski，2012)。霉菌的附著導致仔魚孵化出卵的能耗增加，甚至造成仔魚無法破膜而死亡，這是孵化率降低的原因之一。33.8℃并非海水青鳉孵化臨界溫度的上限。由孵化溫度與孵化率的曲線方程推算出海水青鳉胚胎孵化的理論上限溫度為36.51℃，真實的臨界溫度的上限需要設置更高的溫度梯度進行試驗。

當胚胎發育的溫度系數Q10值約為2時，這一溫度范圍就可以確定為魚類胚胎發育的最適溫度范圍(謝仰杰等，2001)。本研究顯示，溫度為22.5～33.8℃時，Q10值最接近2，綜合考慮孵化率、孵化時間，可以得出海水青鳉胚胎的適宜孵化溫度為24.8～30.5℃，最適溫度在28℃左右。本實驗所用親魚已繁殖3代以上，馴化溫度為27℃ ±1℃，此溫度范圍內海水青鳉攝食及游動行為活躍(王潤萍等，2019)，與胚胎最適孵化溫度相同，此實驗結果與花尾胡椒鯛Plectorhinchus cinctus(謝仰杰等，2001)和斑鱖 Siniperca scherzeri(胡振禧等，2014)的相關研究一致。胚胎的孵化受親魚質量等多種因素的影響，海水青鳉的馴化溫度是否是影響胚胎發育最適溫度的因素需要進一步的實驗驗證。

4 總結

本研究設置6個溫度梯度(19℃、22℃、25℃、28℃、31℃和34℃)探究了不同溫度對海水青鳉胚胎發育的影響。結果表明:海水青鳉胚胎發育最適溫度在28℃左右，升高或降低溫度，都會導致孵化率降低，畸形率增加;胚胎發育時間與溫度呈負相關;胚胎發育的生物學零度為14.89℃，平均有效積溫為3 919.04℃·h。本研究為海水青鳉的胚胎發育研究提供了數據參考。