細胞外基質因子誘導血管化組織工程膜修復半月板損傷研究

楊業靜 ，李興艷，李林，梁紅鎖，黃家志，楊丹凌，杜勇軍?

（1.廣西醫科大學第三臨床醫學院，廣西 南寧 530031；2.廣西醫科大學公共衛生學院，廣西 南寧 530000）

0 前言

半月板是位于股骨內側和膝脛骨平臺之間的兩個纖維軟骨組織，由纖維軟骨組成，內外各有一塊。半月板主要起到穩定關節、增加關節的吻合度等作用，是膝關節運動必不可少的一部分。隨著社會人口老齡化的步入、人民生活水平的提高及人民不良生活飲食習慣的突出，肥胖導致的膝關節半月板損傷是骨科常見疾病。半月板損傷的處理，臨床上治療常規是在關節鏡下予以部分切除修復或半月板縫合，嚴重者則予以半月板全部切除，早期治療效果比較滿意，可在一定程度上減輕患者的膝關節局部疼痛、腫脹，但長期則可能產生關節僵硬、肌肉萎縮、失用性萎縮及膝關節退行性改變等疾病，甚至導致軟骨及軟骨下骨壞死骨關節炎的發生，給患者帶來了極大的痛苦及生活壓力及大幅度降低了患者的生活質量[1]。因此，從一定程度上講，膝關節半月板損傷的處理仍然是骨科疾病中研究的一大難題[2]。同時，隨著異體組織移植的興起，異體或異種半月板移植成為修復半月板損傷可能，但供體組織貨源少及組織排異等現象出現了較多的移植術后并發癥。此外，目前的外科治療還不能有效的解決半月板損傷后修復的問題。近年來，隨著組織工程及干細胞轉化再生的廣泛引用，干細胞聯合組織工程構建人工半月板組織移植成為修復半月板損傷的研究熱點[3]。

對于人工半月板組織原材料的研究，較多的是使用胚胎干細胞、脂肪間充質干細胞、骨髓間充質干細胞、小腸黏膜下層和內皮細胞等作為種子細胞定向分化的研究[4]。眾所周知，滑膜間充質干細胞（synovium-derived stem cells，SDSCs）是指來自于膝關節滑膜的間充質干細胞。此外，目前尚未有關于將SDSCs 作為種子細胞構建完整半月板組織的相關報道。結合本實驗室之前的研究結果及大量的前人研究報道。目前已經證實SDSCs 能通過體外誘導體系從而生成較成熟且均質的軟骨樣組織。然而，SDSCs 的體外軟骨樣組織誘導體系能否在體外成功構建出類似原生態且體積較大的人工半月板形軟骨樣組織有待學者們的深入研究。

在我們的實驗研究中，首先，我們應用兔SDSCs和兔頸靜脈血管內皮細胞為本次實驗的人工種子細胞，同時聯合小腸黏膜下層支架材料，擬在體外構建完整的具有一定力學強度且成熟軟骨組織形態的人工組織工程化半月板。并將其植入半月板損傷區。隨后，在本實驗中，我們對所有新西蘭大白兔進行單獨飼養，并分別于第4、8、12、16 周時采用人工化、理性化方式處死大白兔后取出新形成的人工半月板。最后，我們采用阿爾新藍比色法檢測糖胺多糖（GAG）含量，同時觀察其組織大體形態及生物力學及作為評估指標了解半月板損傷修復情況。進而深入探討細胞外基質因子誘導血管化組織工程膜修復兔膝關節半月板損傷的潛能及可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 SDSCs 的獲取及分離培養

首先，在無菌條件下獲取健康新西蘭大白兔膝關節滑膜組織后，將其加入10mL 的DMEM 培養基的100mm 培養皿中（培養皿中含2mg/mL II 型膠原酶及20%FBS），隨后于5%C02培養箱中消化過夜(約14小時)。同時，過濾提取原代細胞，繼而接種到25 mL 塑料培養瓶內放入培養箱常規培養。經3d 半量換液、5d 全量換液后每3 天換液一次，細胞長滿培養瓶底面積后予以消化、傳代，在倒置顯微鏡下觀察。以第3 代SDSCs 作為種子細胞待用。新西蘭大白兔來自廣西醫科大學動物實驗室中心，胎牛血清購自美國Gibco 公司。

1.1.2 血管內皮細胞的獲取及分離培養

首先，我們在無菌條件下獲取來自健康新西蘭大白兔的頸靜脈血管組織，并將注射器的灌注針頭穿入靜脈一端，用PBS 向靜脈腔內反復注射沖洗已獲得的頸靜脈血管組織，繼而將靜脈內的殘留成分沖洗干凈。隨后，我們取下注射器并抽吸一管空氣，目的是將空氣注人靜脈腔內從而使管腔內的PBS 全部排出。接著，我們再用注射器抽吸一管0.259 毛膜蛋白酶液，將其緩慢推注至靜脈腔中，待另一端有少量酶液流出時，迅速結扎有酶液流出的靜脈端，繼續向靜脈腔內注入膜蛋白酶液，直到靜脈管壁微微充盈鼓起，結扎灌注針頭端的靜脈。最后，我們將兩端結扎的靜脈置人一盛有PBS 的培養皿中，放入37 ℃、5%C02的陪養箱中孵育25 分鐘，繼而剪斷靜脈兩側的結扎線，放出消化液，并用另一帶灌注針頭的注射器注人含20%胎牛血清的 M199 培養液，邊沖洗邊中止消化。最后，實驗人員收集消化液，并置于離心機中離心 5 min；棄上清液，用20%M199 培養液將沉淀的細胞制成懸液，以1.5×105個/mL 接種于培養板中；繼而置于37℃、5%C02培養箱中進行培養，12 h 后進行首次換液，以后隔日換液，倒置顯微鏡下每日進行細胞形態學觀察，作為種子細胞備用。

1.1.3 人工半月板組織的構建

首先，我們選取豬空腸脫細胞的SIS 材料作為實驗使用的支架(新鮮的豬空腸組織從市場購買，具體的分離提取方法見文獻)[5]，并將血管內皮細胞和異體兔SDSCs 作為種子細胞種植在已獲得的載體材料上，隨后在三維條件不同培養基下聯合培養3周，構建血管化組織工程半月板膜，并將組織工程半月板膜多層折疊、修剪整齊至長寬分別約0.4 cm、0.2 cm大小的半月板組織，待以備用。本實驗研究以廣西醫科大學實驗室提供的20 只新西蘭大白兔為動物模型，體重約為2.0-2.4 kg；新西蘭大白兔包括9 只雄性和11 只雌性。

1.2 方法

本實驗共選取上述的20 只健康的新西蘭白兔作為實驗動物。將其固定在手術臺上，并在耳靜脈進行靜脈全麻(2%戊巴比妥鈉，約2mg/kg)。常規消毒及鋪巾后，以膝關節內側及外側弧形切口為手術入路，雙側膝關節同時手術。首先，沿著髕骨上緣到脛骨結節內側進行約0.8 厘米長的皮膚切口。仔細操作，皮膚、皮下組織和筋膜依次分層切割，以防止對膝關節表面軟骨的損傷。隨后，內側半月板前后角、體部和股髁軟骨表面完全暴露，半月板被挑起，整個半月板損傷模型是在內側半月板的前角用鐮刀刀片制作的，損傷處稍微靠近內側半月板的中心。整個操作過程謹慎操作，以防止損傷半月板下軟骨。同時，雙膝關節外側半月板造模操作步驟如同內側半月板損傷造模。完成新西蘭大白兔雙膝關節內外側半月板損傷造模（80 個半月板）時將其（左外、左內、右內、右外）隨機分為4 組（A 組、B 組、C 組、D 組，20 只健康體質新西蘭大白兔膝關節半月板四組之間的分組差異無統計學意義）。A 組植入血管化培養后的人工半月板組織，整齊對合，然后用5-0的可吸收縫線縫合固定；B 組植入未血管化培養的滑膜間充質干細胞-內皮細胞-小腸黏膜下層復合材料，C 組僅植入小腸黏膜下層支架材料，D 組則為自發修復空白對照。隨后逐層縫合皮下組織、皮膚。所有新西蘭大白兔均予單籠飼養。后分別于術后4周、8 周、12 周、16 周處死大白兔并取材（每次5 只，每只均包括A、B、C、D 四組半月板，共20 個半月板），取材時采用大體形態學觀察，并取同等大小的再生組織后采用生物力學測定不同組別彈性模量及采用阿爾新藍比色法檢測糖胺多糖（GAG）平均含量作為評估指標評價半月板損傷修復情況，見圖1。

圖1 兔膝關節囊顯露半月板取材

1.3 觀察指標

①半月板取材后采用大體形態學觀察時，A 組應注意觀察人工半月板植入物的顏色、大小、質地，同時觀察其與正常半月板的銜接是否完整，并仔細觀察植入的人工半月板與周圍正常半月板的差異如光滑度等差異；B 組和C 組應注意觀察是否萎縮、是否有再生組織，若有，則觀察再生組織的顏色、大小、質地，并與正常半月板的差異；D 組應注意觀察半月板造模缺損處是否增大，是否有再生組織，若有，則觀察再生組織是否向中心靠攏，并觀察其與周圍正常半月板組織的差異。此外，還要注意觀察與之接觸的周圍韌帶和軟骨的變化，是否有韌帶損傷即周圍軟骨軟化等情況。在做大體觀察形態學比較時，比較同一時期取材的不同組再生組織的形態學變化，同時比較同組再生組織不同取材時期的形態學變化。②切取修復再生組織標本作彈性模量測定時，比較同體異組半月板彈性模量平均值的變化，同時比較同組異體半月板不同時候的彈性模量平均值的變化。③采用阿爾新藍比色法檢測再生半月板組織糖胺多糖（GAG）含量以評估半月板損傷修復情況，見圖2。

圖2 半月板組織大體形態學觀察

1.4 統計學方法

采用SPSS 16.0 統計軟件對所有數據進行分析，數據用（平均值±標準差）表示，計量資料數據用t檢驗進行檢驗。用卡方檢驗對計數資料數據進行分析，檢驗水平a=0.05，P＜0.05 表明差異有統計學意義。

2 結果

所有實驗動物新西蘭大白兔均存活良好，此次觀察指標一共是80 個半月板組織，但有一只新西蘭大白兔右膝部外側傷口發生感染，有一只新西蘭大白兔左膝關節活動較差，發生攣縮，因此，這兩只新西蘭大白兔的所有半月板組織則不納入觀察對象。其他新西蘭大白兔的傷口均愈合佳，膝關節活動可。所以，在本實驗中，最終觀察的半月板一共為72 個（A、B、C、D 四組均為18 個）。我們采用了大體形態學觀察，并取同等大小的再生組織后采用阿爾新藍比色法檢測GAG 平均含量及采用生物力學測定不同組別彈性模量平均值作為評估指標評價半月板損傷修復情況。其結果如下。

2.1 大體形態學觀察

（1）A 組：術后4 周示人工半月板組織與周圍正常半月板銜接良好，周圍空隙逐漸愈合，植入的人工半月板組織質地較前稍韌；術后 8 周示人工半月板組織與周圍正常半月板邊界較模糊，周圍空隙進一步變小，空隙處逐漸被白色新生組織充填，愈合良好，質地較韌；術后12 周示周圍空隙缺損處已完全被白色半月板樣組織所替代，但表面較粗糙，仍較易與周圍正常半月板組織辨別；術后16 周示人工半月板與周圍正常半月板組織銜接處的再生組織表面光滑，幾乎沒有差別，難以分辨。（2）B 組：術后4 周示人工半月板組織與周圍正常半月板銜接缺損處有部分組織充填，表面柔軟，但其體積較小，仍留有較大空隙；術后8 周示缺損修復區縮小，缺損區大部分已被纖維性組織所替代，表面不光滑；術后12 周示缺損處可見白色纖維疤痕樣組織，并可見橫行或縱行缺損；術后16 周示缺損處已完全被再生組織替代，但表面無A 組16 周時光滑。（3）C 組：術后4 周示缺損處可見部分組織充填，柔軟，小腸黏膜下層支架存在，但其體積較前明顯縮小；術后8周缺損修復區小腸黏膜下層支架材料均完全消失，缺損區大部分已被纖維性組織所替代；術后12 周可見白色纖維疤痕樣組織，并可見橫行或縱行缺損。（4）D 組：術后4 周示缺損清晰可見，未見明顯新生組織生成；術后8 周示缺損處明顯，底部形成少量白色膜狀組織；術后12 周，缺損明顯，無明顯修復跡象，缺損底部有少量纖維組織形成，界限明顯；術后16 周示正常半月板中心萎縮，空隙缺損處較前變大。

2.2 彈性模量測定

生物力學彈性模量測定結果顯示4 組半月板組織的彈性模量隨時間而逐漸增加，A 組半月板4 周、8 周、12 周、16 周的彈性模量分別是：（39.26±1.74）Mpa、（71.09±2.18）Mpa、（99.38±1.98）Mpa、（105.64±3.41）Mpa；A 組標本4 個時間點彈性模量平均值間比較和與其他三組彈性模量平均值之間的比較具有統計學差異，如表1。

表1 半月板彈性模量的測定 (Mpa，)

表1 半月板彈性模量的測定 (Mpa，)

2.3 GAG 含量測定

阿爾新藍比色法檢測再生半月板組織糖胺多糖（GAG）含量結果顯示4 組半月板GAG 含量均隨著時間的增加而增高；在同一時期不同組GAG 含量的差異性比較具有統計學意義；如表2。

表2 兔半月板GAG 含量的測定(ug/mL，)

表2 兔半月板GAG 含量的測定(ug/mL，)

3 討論

膝關節半月板是膝關節結構的重要組件，對減緩重力對脛骨平臺的壓迫及促進膝關節屈伸活動具有重要作用。同時，半月板因其血運差等解剖特點而損傷后難以愈合[6]。因此，對于膝關節半月板的損傷，應盡量予以修復以防止后期膝關節骨性關節炎的發生。目前對于半月板損傷的治療，主要在于外科手術對其進行手術修縫合或部分切除，而術后引發的膝關節骨性關節炎嚴重影響了患者的生活質量[7]。

隨著干細胞分化機制及組織移植組織工程研究的興起，已有部分研究將膝關節半月板損傷的治療朝向干細胞分化軟骨細胞及軟骨組織移植上；如張慶金等人為研究骨關節炎的治療方式時發現骨髓間充質干細胞可定向分化為軟骨細胞[8]；亦如脂肪干細胞、胚胎干細胞、造血干細胞的軟骨分化等[9-11]。這些學者們將干細胞轉分化為軟骨細胞后，聯合細胞外基質支架，再植入半月板缺損處，以此來修復損傷的半月板。

在本研究中，我們利用兔SDSCs 與血管內皮細胞為種子細胞，聯合小腸黏膜下層（SIS）支架材料三維條件下誘導血管化培養成人工半月板組織材料，隨后植入損傷的半月板組織，探討細胞外基質因子誘導血管化組織工程膜修復兔膝關節半月板損傷的潛能及可行性。我們通過血管化的人工半月板組織材料與未血管化培養的滑膜間充質干細胞-內皮細胞-小腸黏膜下層復合材料、小腸黏膜下層支架材料及自發修復之間的比較，確定了血管化培養的滑膜間充質干細胞-內皮細胞-小腸黏膜下層復合材料植入半月板損傷處后，其修復程度及速度均較其他對照組佳，有助于成功構建具有精確形態的組織工程化半月板。

此外，目前對于干細胞分化結合人工半月板移植，較多的層面還停留在單純簡單的單細胞分化，未涉及到半月板組織的血管化組織工程[12]。這類人工半月板組織雖然能簡單的替代半月板組織，具有了半月板軟骨細胞和細胞外基質，但對于半月板組織的血管化來說，還有待進一步的探索，有導致后期的半月板軟骨細胞壞死等的可能[13-14]。而我們的實驗研究則是將SDSCs 和血管內皮細胞聯合作為種子細胞，聯合小腸黏膜下層支架材料在三維條件下誘導培養3 周后，可見明顯的血管化組織。我們將其植入半月板損傷處后通過GAG 含量測定均與正常半月板相近，這些實驗數據均證明了人工復合物組織已構建成完整的具有一定力學強度且成熟軟骨組織形態的人工組織工程化半月板，且殘存的未降解材料量較少。該實驗結果表明這種實驗方案保證了軟骨的良好形成及降低了回植體內后的炎癥反應。此外，生物力學測試結果表明，血管化人工半月板的彈性模量較高，更接近正常人的半月板。

同時，本研究發現在以SDSCs 與血管內皮細胞為種子細胞，聯合小腸黏膜下層支架材料三維培養時，SDSCs 與血管內皮細胞相容性、相鄰細胞貼靠小腸黏膜下層支架交織生長。A 組毛刺狀突起明顯多于其他對照組，B 組可見少許毛刺狀突起，證實了A 組血管化明顯高于其他各組，這提示血管化后的人工半月板組織更有利于損傷半月板的修復。

綜上所述，本研究證實了SDSCs 具有軟骨細胞分化能力，并與血管內皮細胞相容性較好；同時證實了血管化后的人工半月板組織較單一的人工半月板組織更能修復半月板的損傷。本實驗不僅為細胞治療的臨床轉化研究提供了一定的理論基礎，而且為以后半月板修復方法研究鑒定了良好的基礎。具有一定的借鑒意義。

4 結論

以小腸黏膜下層為支架材料，以滑SDSCs 和內皮細胞為種子細胞，經體外擴增及細胞因子刺激血管化培養后的再生組織，植入兔關節腔內修復半月板局部缺損的方法，具有一定的借鑒意義。