microRNA-148b在肝細胞癌組織中的表達及其臨床意義

郝余慶　蔣徐維　徐玉振

(1.上海市寶山區中西醫結合醫院普外科，上海　201900；

2.江蘇省徐州市中心醫院胃腸外科，江蘇徐州　221009)

?

·論著·

microRNA-148b在肝細胞癌組織中的表達及其臨床意義

郝余慶1蔣徐維1徐玉振2

(1.上海市寶山區中西醫結合醫院普外科，上海201900；

2.江蘇省徐州市中心醫院胃腸外科，江蘇徐州221009)

摘要目的：探討肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)組織中microRNA-148b(miR-148b)的表達與HCC預后的關系。方法： 從上海中醫藥大學附屬曙光醫院冰凍組織樣本庫中調取2007—2010年手術切除的HCC組織及相應癌旁組織標本，采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)法檢測組織標本中miR-148b的表達情況，結合臨床病理指標及生存資料，分析miR-148b表達改變的臨床意義。結果：與癌旁組織比較，HCC組織中miR-148b表達水平顯著降低(P<0.01)。miR-148b低表達與HCC血管侵犯及TNM分期等惡性臨床病理指標相關。Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，miR-148b低表達組患者總生存率較低。結論：人HCC組織中miR-148b表達下降，且與HCC不良的臨床預后有關。

關鍵詞肝細胞癌；microRNA-148b；總生存期；預后

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是我國最常見的消化道惡性腫瘤，惡性程度高，病死率高[1]。在過去20年中，HCC發病率在全世界范圍內迅速上升[2]。目前，手術切除HCC仍是使患者獲得長期生存的最有效措施，但大部分HCC患者就診時已屬晚期，并多伴有嚴重的肝硬化，接受手術治療者不到10%[3]。探索HCC侵襲轉移機制、尋找新的臨床治療靶點在HCC的治療中具有重要意義。

近年來研究[4-5]發現，包括HCC在內的多種惡性腫瘤的發生與細胞內DNA甲基化有關。啟動子區高甲基化可導致一系列抑癌基因的轉錄失活，因而在惡性腫瘤的進展過程中具有重要作用。研究[6-7]發現，在HCC組織和細胞中DNA甲基轉移酶DNMT3B表達顯著上調，但其調控機制尚不清楚。有研究[8]認為microRNA-148b(miR-148b)對DNMT3B具有負調控作用。miR-148b可通過下調DNMT3B表達從而抑制細胞內DNA甲基化，因此，推測miR-148b可在一定程度上逆轉腫瘤進展。研究表明，miR-148b在乳腺癌[9]、胃癌[10]、結腸癌[10]、胰腺癌[11]、肺癌[12]等多種腫瘤組織中低表達，且與腫瘤惡性表型和進展相關。然而，關于miR-148b在HCC組織中的表達情況及其與HCC患者的預后關系的研究報道，目前尚少見。本研究通過檢測miR-148b在HCC組織中的表達情況，并分析miR-148b的表達水平與HCC患者的臨床病理指標及隨訪資料的關系，探討miR-148b的表達與HCC患者臨床預后的關系。

1資料與方法

1.1標本來源選擇2007—2010年上海中醫藥大學附屬曙光醫院手術切除的HCC組織及相應癌旁組織，并根據WHO病理分類進行病理復讀和分類。組織標本的獲取和保管按照上海醫藥大學曙光醫院普外科手術樣本獲取標準操作規程(SOP)的要求進行。所有組織樣本均在切除后立即置于液氮中。入選患者術前未接受化療及其他抗癌治療。共入選60例患者，年齡45～79歲；其中男性39例，女性21例。本研究經上海中醫藥大學附屬曙光醫院倫理委員會批準，患者或其家屬均在手術前簽署知情同意書。

1.2實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)法檢測miR-148b表達水平采用Trizol試劑盒(美國Invitrogen公司)，從HCC組織及癌旁組織中提取總RNA。應用TaqMan miRNA分析儀(美國Applied Biosystems公司)，采用miR-148b和U6內參基因特異的引物，從總RNA逆轉錄合成cDNA。應用ABI 7500系統(美國Applied Biosystems公司)進行RT-qPCR，檢測miR-148b和U6內參基因的表達，均重復3次。miR-148b相對表達量采用公式2-ΔΔCt計算，以U6為內參進行標準化處理。采用SDS2.2.2軟件(美國Applied Biosystems公司)分析結果。

1.3miR-148b與HCC臨床病理指標的關系根據患者的病例資料，分析miR-148b與HCC患者年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤TNM分期、血管浸潤、分化程度、甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)水平等臨床病理指標的關系。

1.4統計學處理采用SPSS 20.0軟件進行統計學分析，HCC與癌旁組織miR-148b表達的比較采用t檢驗。miR-148b表達和臨床病理指標關系的分析采用Mann-Whitney U檢驗或Kruskal-Wallis檢驗。采用Kaplan-Meier法進行生存曲線分析，采用對數秩和檢驗(Log-rank)法進行生存分布的分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1miR-148b的表達水平比較RT-qPCR檢測結果表明，HCC組織中miR-148 b相對表達水平為1.33±0.29，低于癌旁組織(1.92±0.30)，差異有統計學意義(P<0.01)。

2.2HCC臨床病理指標與miR-148b表達水平的相關性分析根據HCC組織中的miR-148b表達水平(均數-標準差=1.62)將60例分為miR-148 b低表達組(表達水平<1.62，n=32)與高表達組(表達水平≥1.62，n=28)。miR-148 b表達水平與腫瘤TNM分期、血管侵犯及血清AFP水平均密切相關(P<0.01)。但2組在性別、年齡、腫瘤大小、有無衛星病灶、分化程度、合并疾病方面差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1　HCC組織中miR-148b表達水平與HCC臨床病理指標的相關性分析　(n，%)

續表1

2.3miR-148b表達降低與預后不良有關60例患者隨訪時間為28～71個月，其中37例(61.7%)患者死亡，中位生存期為37個月。Kaplan-Meier生存分析以及對數秩和檢驗表明，miR-148b的表達情況與HCC患者的生存時間密切相關。miR-148b低表達組總生存時間短于高表達組(P<0.01)，其中低表達組中位生存時間為31個月[95%可信區間(CI)：

22～40]，而高表達組為46個月(95%CI：40～53) ，見圖1。低表達組死亡未調整風險比(hazard ratio，HR)是高表達組的2.78倍(95%CI：1.19～6.55，P<0.05)。此外，HCC患者的生存時間還與腫瘤大小、TNM分期以及血管侵犯有關。但是，性別、年齡、組織分化、肝硬化、乙肝病毒感染或血清AFP水平對HCC患者的整體生存率沒有預測價值。見表2。

圖1　miR-148b表達水平與HCC患者預后的關系

項目HR值95%CIP值性別(男性/女性)1.2170.671~2.1250.659年齡(<60歲/≥60歲)1.1150.681~2.3430.869腫瘤直徑(<5cm/≥5cm)4.4531.154~14.8070.043組織分化程度(低分化/高、中分化)1.4130.487~4.0980.524血管浸潤(無/有)5.5841.695~17.6100.034TNM分期(Ⅰ/Ⅱ~Ⅲ)4.9831.254~18.1670.033miR-148b表達(高/低)2.7861.188~6.5530.019血清AFP水平(<20ng/mL/≥20ng/mL)0.5810.285~1.1660.106肝硬化(無/有)0.8350.393~1.7770.641病毒感染(無/有)3.1251.206~13.5800.885

3討論

本研究率先在國內報道了miR-148b在中國HCC患者癌組織及癌旁組織中的表達情況，并發現miR-148b表達降低與患者預后差有關，提示miR-148b表達水平有可能成為判斷HCC患者預后的指標，miR-148b有望成為治療HCC的新靶點。

miR-148b定位于12q13.13。一般認為，miR-148b在惡性腫瘤組織中低表達，并且體外轉染miR-148b具有抑制腫瘤增殖的作用。但是，也有研究[13]發現，miR-148b在卵巢癌中表達增加，顯示出miR-148b的組織特異性。目前，關于miR-148b在HCC組織中的表達尚未有報道。在HCC細胞水平的研究[14]顯示，與正常肝細胞相比，miR-148b表達水平在HCC細胞株(HepG2、MHCC97L和MHCC97H)中下調，提示miR-148b可能有一定的抑癌作用，但是關于人HCC組織與癌旁組織中miR-148b表達水平的相關比較研究，目前尚不多見。

本研究通過RT-qPCR方法比較了60例人HCC組織和相應癌旁組織中miR-148b的表達水平，并研究了miR-148b表達與HCC患者臨床病理指標的關系。結果發現，miR-148b在HCC組織中表達水平低于癌旁組織。進一步分析miR-148b異常表達與臨床病理指標的關系，結果顯示，低表達的miR-148b與HCC血管侵犯和TNM分期有關，提示miR-148b低表達與HCC進展期病理特征有關。

Kaplan-Meier生存分析以及對數秩和檢驗表明，miR-148b低表達組與高表達組相比，患者整體生存率更差。低表達組死亡未調整HR值是高表達組的2.78倍，提示miR-148b表達降低與預后差有關。

miRNAs常通過控制多個靶點mRNA并改變其生物功能而影響腫瘤進展[15]。此外，miRNA在不同組織中發揮的生物學效應也可能存在差異。因此，miR-148b在HCC細胞中的表達調控可能具有其獨特性。另外，由于本組病例是回顧性隨訪，并未對循環血液中的miR-148b水平進行測定，無法分析循環中miR-148b水平與HCC患者預后之間的關系，有待進一步研究。

總之，miR-148b作為一個具有腫瘤抑制作用的miRNAs在人HCC的生成以及惡化中發揮了重要作用。

參考文獻

[1]葉勝龍.2013年肝癌領域新進展[J].中華肝臟病雜志,2014,22(1):2-4.

[2]樊嘉,王征.肝癌外科治療的進展[J].實用醫院臨床雜志,2011,8(1):16-19.

[3]樊嘉,周儉,徐泱,等.肝癌肝移植適應證的選擇:上海復旦標準[J].中華醫學雜志,2006,86(18):1227-1231.

[4]Duan F,Cui S,Song C,et al.Systematic evaluation of cancer risk associated with DNMT3B polymorphisms[J].J Cancer Res Clin Oncol, 2015, 141(7): 1205-1220.

[5]Arakawa Y,Watanabe M,Inoue N,et al.Association of polymorphisms in DNMT1,DNMT3A,DNMT3B,MTHFR and MTRR genes with global DNA methylation levels and prognosis of autoimmune thyroid disease[J].Clin Exp Immunol,2012,170(2):194-201.

[6]Maekawa F,Shimba S,Takumi S,et al. Diurnal expression of Dnmt3b mRNA in mouse liver is regulated by feeding and hepatic clockwork [J]. Epigenetics, 2012,7(9):1046-1056.

[7]Xiao Y,Word B,Starlard-Davenport A,et al.Age and gender affect DNMT3a and DNMT3b expression in human liver[J].Cell Biol Toxicol, 2008,24(3):265-272.

[8]Borel F,Konstantinova P,Jansen PL.Diagnostic and therapeutic potential of miRNA signatures in patients with hepatocellular carcinoma[J]. J Hepatol,2012, 56(6):1371-1383.

[9]Cimino D,De Pittà C,Orso F,et al.miR148b is a major coordinator of breast cancer progression in a relapse-associated microRNA signature by targeting ITGA5,ROCK1,PIK3CA,NRAS,and CSF1[J].FASEB J,2013,27(3):1223-1235.

[10]Song Y,Xu Y,Wang Z,et al.MicroRNA-148b suppresses cell growth by targeting cholecystokinin-2 receptor in colorectal cancer[J].Int J Cancer, 2012, 131(5):1042-1051.

[11]Zhao G,Zhang JG,Liu Y,et al.miR-148b functions as a tumor suppressor in pancreatic cancer by targeting AMPKα1[J].Mol Cancer Ther,2013,12(1):83-93.

[12]Yang JS,Li BJ,Lu HW,et al.Serum miR-152, miR-148a,miR-148b,and miR-21 as novel biomarkers in non-small cell lung cancer screening[J].Tumour Biol,2015,36(4):3035-3042.

[13]Chang H,Zhou X,Wang ZN,et al.Increased expression of miR-148b in ovarian carcinoma and its clinical significance[J].Mol Med Rep,2012,5(5):1277-1280.

[14]Zhao Y,Jia HL,Zhou HJ,et al.Identification of metastasis-related microRNAs of hepatocellular carcinoma in hepatocellular carcinoma cell lines by quantitative real time PCR[J].Chinese Journal of Hepatology,2009,17(7):526-530.

[15]Lu J,Getz G,Miska EA,et al.MicroRNA expression profiles classify human cancers[J].Nature,2005,435(7043):834-838.

Expression of MicroRNA-148b in Hepatocellular Carcinoma Tissue and Its Clinical Significance

HAOYuqing1JIANGXuwei1XUYuzhen2

1.DepartmentofGeneralSurgery,BaoshanHospitalofIntegratedChineseandWesternMedicine,Shanghai201900,China; 2.DepartmentofGastrointestinalSurgery,XuzhouCentralHospital,Xuzhou221009,China

AbstractObjective：To investigate the relationship between the expression of microRNA-148b(miR-148b) in human hepatocellular carcinoma (HCC) and the prognosis of HCC. Methods:The specimens of HCC tissue and para-carcinoma tissue acquired by surgical resection during 2007 and 2010 were collected from frozen tissue specimen library of Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine. The expression of miR-148b in tissue specimen was detected by real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR).The clinical significance of expression change of miR-148b was analyzed by considering the clinical pathological indicators and survival data. Results: The expression level of miR-148b in HCC was significantly lower than that in para-tumor tissues(P<0.01). Low expression of miR-148b was associated with HCC malignant clinical pathological indicators such as vascular invasion and TNM stage.Kaplan-Meier survival curve analysis showed that the patients with low expression of miR-148b had poor overall survival rate. Conclusions: The expression of miR-148b decreases in human HCC tissue. And it is associated with the poor clinical prognosis.

Key WordsHepatocellular carcinoma；microRNA-148b；Overall survival；Prognosis

中圖分類號R 735.7

文獻標識碼A