高小卓，張輝，喬鋆，王楠，楊世華，張繼福，馬詩揚，李記彬，石剛，張睿

[1.中國醫科大學腫瘤醫院（遼寧省腫瘤醫院） 病理科，遼寧 沈陽 110044；2.丹東市人民醫院 呼吸腫瘤科，遼寧 丹東 118000；3.中國醫科大學腫瘤醫院（遼寧省腫瘤醫院） 結直腸外科，遼寧 沈陽 110044]

結直腸癌在全球發病率呈上升趨勢，隨著化療及靶向治療藥物的發展，整體生存率較10 余年前有明顯升高[1]。對結直腸癌早期診斷的分子生物學標志物的探索，以及對靶向治療靶點的研究可能是進一步提高晚期結直腸癌患者生存率的主要方向[2]。MicroRNA 可以對靶mRNA 3'-UTR 端進行特異性識別，其組成為單鏈非編碼RNA 長度為18 ～22 個核苷酸，對下游靶mRNA 降解進行調控或接受上游基因的調控，阻斷翻譯過程，對惡性腫瘤的行為有重要的調控作用[3]。有研究顯示，microRNA-93（miR-93）能夠抑制結腸癌細胞的增殖，與結腸癌發生、發展有重要聯系[4]。四跨膜蛋白超家族成員Tspan1 是細胞膜內外信號傳導的重要通路，對細胞遷移、侵襲等行為具有調控作用，有研究顯示Tspan1 在胰腺癌中表達升高，并與侵襲、轉移具有相關性[5-6]。本研究對組織及細胞中miR-93 及Tspan1 表達進行檢測，并分析其與臨床病理特征的關系及兩者的相關性，為進一步研究miR-93 與Tspan1 的靶向調控關系提供前期實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

選取2016年5月—2018年4月于中國醫科大學腫瘤醫院結直腸外科行結腸癌根治術的患者74 例，取其手術標本，包括結腸癌組織及對應的距腫瘤邊緣＞5 cm 的癌旁組織。人結腸癌細胞株（SW480、SW620、HCT116、CaCo-2、LoVo、HT29）購 自 中 國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心，正常人結腸上皮細胞株（FHC）購自美國ATCC 公司，于中國醫科大學腫瘤醫院中心實驗室培養傳代擴增。Tspan1 多克隆抗體購自美國Sigma 公司，BCA 蛋白定量分析試劑盒購自北京博凌科為公司，逆轉錄試劑盒購自立陶宛Fermentas 公司，microRNA 提取分離試劑盒購自美國Abcom 公司，All-in-One qPCR Mix 試劑盒及MTT 試劑盒購自大連寶生生物技術有限公司，引物由大連寶生生物技術有限公司設計并合成。本研究經中國醫科大學腫瘤醫院倫理委員會審核（No：20180336）。

1.2 方法

1.2.1 Western blotting取組織或細胞株，將組織或細胞進行預處理后做蛋白濃度定量。使用裂解液對蛋白進行裂解、震蕩、充分搖勻，完成總蛋白的提取，然后提取上清液，應用BCA 蛋白定量分析試劑盒進行蛋白濃度定量。使用10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳將蛋白分離，轉至PVDF 膜。5%的脫脂奶粉在室溫下封閉90 min，加一抗，孵育過夜，TBST洗滌加二抗，再次孵育，再用TBST 洗滌，化學發光法顯色，以β-actin 為內參照。以Quantity One 監測灰度值，蛋白相對表達量=目標蛋白灰度值/內參照蛋白灰度值。

1.2.2 qRT-PCR取組織或細胞標本，使用Trizol試劑盒進行總RNA 提取及純化，嚴格按照試劑盒使用說明書進行相關操作，使用DNasel 去除污染的DNA，分光光度計檢查OD 260/280=1.8 ～2.0，無蛋白和苯酚污染，甲醛變性瓊脂糖電泳法檢測RNA 完整性，后立即逆轉錄為cDNA，獲得樣本cDNA 產物，滅活逆轉錄酶，進行PCR 反應。按照All-in-One qPCR Mix 試劑盒使用說明書進行實時監測和定量擴增產物。采用2-ΔΔCt法分析熔解曲線。

1.3 統計學方法

數據分析采用SPSS 21.0 統計軟件，生物信息學預測軟件為TargetScan 及GeneCard。計量資料以均數±標準差（±s）表示，兩組比較用t檢驗，多組比較用單因素方差分析，采用Pearson 法進行相關性分析，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-93、Tspan1 mRNA 及蛋白在結腸癌、癌旁組織中的表達

miR-93 在結腸癌組織與癌旁組織中的表達差異有統計學意義（t=12.33，P=0.000），miR-93 在結腸癌組織中表達較低。Tspan1 mRNA 在結腸癌組織與癌旁組織中的表達差異有統計學意義（t=4.312，P=0.000），Tspan1 mRNA 在結腸癌組織中表達較高。Tspan1 蛋白相對表達量在結腸癌組織與癌旁組織中的表達差異有統計學意義（t=10.980，P=0.000），Tspan1 蛋白在結腸癌組織中表達較高。見圖1。

2.2 miR-93、Tspan1 mRNA 及蛋白在人結腸癌細胞株、正常人結腸上皮細胞中的表達

miR-93、Tspan1 mRNA 及蛋白在人結腸癌細胞株（SW480，SW620，HCT116，CaCo-2，LoVo，HT-29）及正常人結腸上皮細胞株（FHC）中的表達差異有統計學意義（F=9.098、4.576 和5.516，均P=0.000）。與正常人結腸上皮細胞株比較，miR-93 在人結腸癌細胞株中表達較低（P＜0.05）；Tspan1 mRNA 在人結腸癌細胞株中表達較高（P＜0.05）；Tspan1 蛋白在人結腸癌細胞株中表達較高（P＜0.05）。見表1。

2.3 miR-93 及Tspan1 mRNA 表達與臨床病理特征的關系

結腸癌組織中miR-93 及Tspan1 mRNA 在患者不同年齡、性別、腫瘤位置、腫瘤直徑、腫瘤浸潤深度、病理分型、腫瘤分化程度患者中的表達無差異（P＞0.05），miR-93 在遠處轉移（M1）、淋巴結轉移陽性、血管浸潤陽性及高TNM 分期患者中的表達低（P＜0.05），Tspan1 mRNA 在遠處轉移（M1）、淋巴結轉移陽性、血管浸潤陽性及高TNM 分期患者中的表達高（P＜0.05）。miR-93 及Tspan1 mRNA 在結腸癌是否具有血行及淋巴轉移的臨床病理特征表達差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

2.4 miR-93 與Tspan1 mRNA 相關性分析及生物信息學預測

采用Pearson 法對miR-93 與Tspan1 mRNA 進行相關性分析，結果顯示，在結直腸癌組織中，miR-93 與Tspan mRNA 表達呈負相關[r=-0.735（95% CI：-0.855，-0.535），P=0.000]。經生物信息學預測，miR-93 及Tspan1 在3'-UTR 區可能具有靶向調控關系。見圖2。

圖1 miR-93、Tspan1 mRNA 及蛋白在結腸癌組織及癌旁組織中的表達

表1 miR-93、Tspan1 mRNA 及蛋白在人結腸癌細胞株及正常人結腸上皮細胞株中的表達 （±s）

表1 miR-93、Tspan1 mRNA 及蛋白在人結腸癌細胞株及正常人結腸上皮細胞株中的表達 （±s）

指標 SW480 SW620 HCT116 CaCo-2 LoVo HT-29 FHC miR-93 0.468±0.199 0.488±0.136 0.688±0.199 0.403±0.046 0.522±0.217 0.494±0.168 1.287±0.142 Tspan1 mRNA 1.140±0.383 1.203±0.147 0.928±0.201 0.866±0.298 0.696±0.154 1.024±0.151 0.399±0.049 Tspan1 蛋白 16.301±4.516 19.314±3.068 18.602±2.945 15.961±2.952 15.343±0.571 12.268±3.104 7.598±2.016

表2 結腸癌患者臨床病理特征與miR-93 及Tspan1 mRNA 表達的關系 （±s）

臨床病理特征 n miR-93 t /F 值 P 值 Tspan1 mRNA t / F 值 P 值性別男40 0.314±0.208 1.732 0.088 0.576±0.290 1.531 0.130女34 0.242±0.137 0.671±0.233年齡≤60 歲 42 0.273±0.169 0.623±0.235 0.412 0.682 0.130 0.897＞60 歲 32 0.291±0.199 0.615±0.310腫瘤位置左半結腸 42 0.272±0.206 0.640±0.297 0.474 0.637 0.725 0.471右半結腸 32 0.293±0.146 0.594±0.226腫瘤直徑≤5 cm 48 0.276±0.172 0.623±0.254 0.330 0.743 0.128 0.899＞5 cm 26 0.291±0.201 0.614±0.298浸潤深度T1、T2 22 0.242±0.109 0.639±0.161 1.204 0.233 0.392 0.696 T3、T4 52 0.298±0.203 0.612±0.304淋巴結轉移N0 42 0.340±0.179 0.534±0.240 3.022 0.003 3.375 0.001 N1、N3 32 0.212±0.163 0.733±0.265遠處轉移M0 58 0.317±0.180 0.561±0.248 3.525 0.001 3.937 0.000 M1 16 0.149±0.116 0.833±0.235血管浸潤陰性 38 0.330±0.191 2.442 0.017 0.562±0.262 2.305 0.024陽性 36 0.230±0.157 0.700±0.251 TNM 分期Ⅰ、Ⅱ期 32 0.350±0.213 0.524±0.290 2.995 0.004 3.165 0.002Ⅲ、Ⅳ期 42 0.229±0.133 0.709±0.212大體形態分類腫塊型 36 0.342±0.182 0.594±0.243潰瘍型 20 0.199±0.156 0.987 0.330 0.792±0.234 1.322 0.190浸潤型 18 0.251±0.171 0.505±0.276分化程度高、中 40 0.288±0.197 0.352 0.726 0.625±0.280 0.149 0.882低34 0.273±0.164 0.634±0.247

圖2 miR-93 與Tspan1 mRNA 相關性分析及生物信息學預測

3 討論

結直腸癌目前是消化系統最常見的惡性腫瘤之一，化療藥物及靶向藥物的發展是晚期結直腸癌患者生存期延長的最主要原因[7-9]。miRNA 具有表達穩定的特征，對腫瘤發生及發展具有重要調控作用，并參與惡性腫瘤相關的信號通路調控[10-11]。miRNA 在惡性腫瘤的診斷、預后評價及靶向治療中具有重要的應用價值[12-13]。XIANG 等[14]研究結果顯示，miR-93會抑制SW1116 干細胞增殖及克隆形成，是抑癌基因。以往研究報道[15]Tspan1 在胰腺癌中與臨床分期呈正相關，與癌癥患者的生存率呈負相關，對胰腺癌細胞的侵襲轉移具有促進作用，這種促進作用是通過調控MMP2 表達及PLCγ 磷酸化實現，Tspan1是一種促癌基因。另有研究顯示[16]，miR-200a 可以通過調控Tspan1 表達誘導非小細胞肺癌細胞的遷移，表明Tspan1 對惡性腫瘤細胞增殖、侵襲、凋亡的調控可以受到上游miRNA 的調控。通過生物信息學分析預測miR-93 及Tspan1 在3'-UTR 區可能具有靶向調控關系，本研究分析了結腸癌患者臨床病理特征與miR-93及Tspan1 mRNA 表達的關系，把兩者在信號通路方面的靶向調控關系作為前期實驗研究基礎。

本研究顯示,與癌旁組織比較，miR-93 在結腸癌組織中低表達，Tspan1 mRNA 及蛋白在結腸癌組織中高表達，與正常人結腸上皮細胞比較，miR-93 在人結腸癌細胞株中低表達，Tspan1 mRNA 及蛋白在人結腸癌細胞株中高表達。miR-93 在遠處轉移（M1）、淋巴結轉移陽性、血管浸潤陽性及高TNM 分期患者中表達低，Tspan1 mRNA 在遠處轉移、淋巴結轉移陽性、血管浸潤陽性及高TNM 分期患者中表達高。這部分研究表明，miR-93 可能與結直腸癌轉移的惡性行為有關，可能作為抑癌基因發揮作用，而Tspan1 可能作為促癌基因發揮作用。YANG 等[17]研究顯示，在前列腺癌中，miR-93 是重要的預測因子及預后因子，在前列腺癌中低表達，miR-93 對KEGG 通路的靶向調控作用可能是前列腺癌靶向治療的候選基因。CHEN 等[18]在胃癌的研究中顯示，Tspan1 高表達的患者中位生存期短，TNM分期更差。CHEN等[19]在肝癌的研究中也顯示，Tspan1 高表達的肝癌患者生存期短。SCHOLZ 等[20]在卵巢癌的研究中顯示，Tspan1 是轉移性卵巢癌不良預后的標志物，可能作為未來的治療靶點。本研究顯示，miR-93 與Tspan mRNA 表達呈負相關，經過生物信息學預測，miR-93 及Tspan1 在3'-UTR 區可能具有靶向調控關系。在進化上miRNA 是高度保守的內源性非編碼單鏈RNA，對基因的調控是在轉錄后水平。在基因組中，miRNA 具有不同編碼，編碼miRNA 前體（premiRNA）。pre-miRNA 是發夾結構，而且是單一的，5'-端具備磷酸基團，3'-具備突出堿基2個及3'-羥基1個，miRNA 可以抑制mRNA 的蛋白傳遞，這是通過與靶mRNA3'-UTRs 互補結合實現的，從而調控下游基因的表達，從而抑制或破壞mRNA 蛋白傳遞，對基因表達產生負調控作用[21-22]。miRNA 表達失調與多種惡性腫瘤發生及發展具有相關性。有研究顯示，在乳腺癌中，miR-93 通過抑制MKL-1 及STAT3 表達介導細胞表皮間質化形成，從而調控乳腺癌細胞轉移，與化療耐藥也具有相關性[14]。本研究通過生物信息學預測miR-93與Tspan1 可能存在調控關系，在組織水平觀察兩者在結直腸癌組織中的表達，并分析兩者與臨床病理特征的關系，從統計學方面論證兩者的相關性，為結直腸癌的診斷及預后預測靶基因的發現，為治療靶向候選基因的探索，提供臨床實驗依據，為進一步的在體實驗打下基礎。

綜上所述，miR-93 在結腸癌中表達下調，Tspan1在結腸癌中表達上調，miR-93 可能與Tspan1 mRNA具有靶向調控關系，兩者可能成為結腸癌的腫瘤標志物或預測因子，可以通過進一步實驗證明其是否可以成為靶向治療的靶點。