高通量測(cè)序及其在分子診斷領(lǐng)域的應(yīng)用

張閆佳

高通量測(cè)序及其在分子診斷領(lǐng)域的應(yīng)用

張閆佳

（河南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453007）

隨著DNA測(cè)序技術(shù)的進(jìn)一步成熟，我們對(duì)人類(lèi)基因組和各類(lèi)疾病在基因方面的研究得到了很大進(jìn)展。通過(guò)對(duì)人類(lèi)的基因組進(jìn)行測(cè)序，我們已經(jīng)能夠比較全面地了解某些基因是如何運(yùn)行的及其形式、功能。尤其在某些疾病的診斷方面，高通量測(cè)序技術(shù)（HTS）發(fā)揮著更大的作用。通過(guò)對(duì)患者病變細(xì)胞的基因組進(jìn)行測(cè)序，已經(jīng)能夠?qū)υ摲N疾病進(jìn)行更深入的研究，以改善許多疾病的診斷分類(lèi)、預(yù)后和治療選擇。這種新的DNA測(cè)序方法正在向臨床過(guò)渡，且可能使醫(yī)學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域，如診斷領(lǐng)域產(chǎn)生較大的變化。在這里將介紹目前為止利用高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行研究，進(jìn)而得到的一些主要發(fā)現(xiàn)結(jié)果，有助于了解高通量測(cè)序在心血管疾病、智力障礙和苯丙酮尿癥等疾病分子診斷中的應(yīng)用。

DNA測(cè)序技術(shù)；高通量測(cè)序；分子診斷；基因

1 前言

隨著科技的進(jìn)步，人類(lèi)的壽命也越來(lái)越長(zhǎng)，這與人們對(duì)疾病方面的研究有著極大關(guān)系。以前，人們以為疾病是一種懲罰，沒(méi)有任何科學(xué)依據(jù)。現(xiàn)在，隨著人們對(duì)環(huán)境和人類(lèi)基因的認(rèn)知越來(lái)越深刻，人們了解到目前為止很多疾病都與環(huán)境或者基因，其中尤其是遺傳病與基因有著非常大的關(guān)聯(lián)。而從低通量測(cè)序到當(dāng)下的高通量測(cè)序，我們對(duì)基因組的序列的理解更勝一籌。高通量測(cè)序技術(shù)能夠?qū)Χ鄠€(gè)DNA分子進(jìn)行并行測(cè)序，甚至使數(shù)億個(gè)DNA分子做到同時(shí)測(cè)序。這一優(yōu)勢(shì)使得高通量測(cè)序可以用于創(chuàng)建大數(shù)據(jù)庫(kù)，使我們對(duì)各種疾病和發(fā)育階段的細(xì)胞基因組和轉(zhuǎn)錄組的特征有一個(gè)更全面的了解。高通量測(cè)序技術(shù)不僅極大地提高了DNA測(cè)序的效率，而且在很大程度上降低了成本。同時(shí)，由于該技術(shù)通常具有較好的特異性、較高的靈敏度和準(zhǔn)確性，它在轉(zhuǎn)錄組學(xué)、表觀(guān)基因組學(xué)以及基因變異的研究中有了很好的應(yīng)用。

DNA測(cè)序技術(shù)的此項(xiàng)進(jìn)展意味著病理學(xué)家、遺傳學(xué)家和其他醫(yī)學(xué)學(xué)科的成員現(xiàn)在看到的是大量新的遺傳數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)為疾病的易感性、發(fā)病機(jī)制、預(yù)后和治療策略提供了很大的幫助。而對(duì)于我們來(lái)說(shuō)，了解這些使用新的高通量測(cè)序技術(shù)獲得的數(shù)據(jù)、在獲得測(cè)序結(jié)果后做出的選擇以及在數(shù)據(jù)分析和表觀(guān)遺傳等方面是至關(guān)重要的。此外，除了處理這些數(shù)據(jù)得到的顯而易見(jiàn)的結(jié)果之外，這些大量的高通量測(cè)序數(shù)據(jù)還包含了一些其他的發(fā)現(xiàn)，盡管有的發(fā)現(xiàn)目前的意義還不是很明確。但當(dāng)進(jìn)行到相關(guān)研究時(shí)，一定會(huì)顯現(xiàn)出它的用途。

2 高通量測(cè)序與分子診斷

2.1 高通量測(cè)序技術(shù)

基因被轉(zhuǎn)錄成RNA，然后RNA被翻譯成蛋白質(zhì)，這即是分子生物學(xué)的中心法則。這個(gè)法則概述了基因的可變表達(dá)——如何從單個(gè)基因組動(dòng)態(tài)地控制細(xì)胞地位和功能。基因是恒定的，但基因表達(dá)是動(dòng)態(tài)的，而且會(huì)受到轉(zhuǎn)錄和翻譯的影響，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)主要功能發(fā)生改變。

如果潛在的DNA序列發(fā)生突變，或者在轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程中發(fā)生改變，細(xì)胞功能就可能受到影響，進(jìn)而導(dǎo)致各種疾病的發(fā)生。雖然細(xì)胞所在的環(huán)境也會(huì)影響疾病的表現(xiàn)，但是許多疾病也有一個(gè)強(qiáng)大的潛在遺傳成分。因此，為了評(píng)估一個(gè)人的遺傳背景是否會(huì)導(dǎo)致疾病，需要大量的基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)。通過(guò)對(duì)多個(gè)基因組進(jìn)行測(cè)序，可以研究人類(lèi)基因組的多樣性。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的逐步發(fā)展，測(cè)序成本已經(jīng)大大降低，很快就可以以更低的價(jià)錢(qián)來(lái)測(cè)序整個(gè)人類(lèi)的基因組了。盡管如此，目前還面臨著一個(gè)重要的挑戰(zhàn)——將基因組測(cè)序用于臨床方面的數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可靠性。其實(shí)，每一種DNA測(cè)序技術(shù)都不可避免地有其錯(cuò)誤模式和出錯(cuò)率。當(dāng)前，許多高通量測(cè)序應(yīng)用程序試圖通過(guò)為每個(gè)要確定的堿基獲得許多獨(dú)立的序列，來(lái)克服這個(gè)障礙。在不久的將來(lái)，從高通量測(cè)序?qū)嶒?yàn)中獲得的復(fù)雜數(shù)據(jù)的解釋?zhuān)瑢⒋蟠笥幸嬗谏飳W(xué)的研究。

靶向高通量測(cè)序基本是對(duì)患者的患病細(xì)胞進(jìn)行測(cè)序，經(jīng)過(guò)擴(kuò)增后使用Illumina高通量測(cè)序方法進(jìn)行測(cè)序。其中，可以利用在線(xiàn)設(shè)計(jì)工具設(shè)計(jì)一組測(cè)序引物，對(duì)若干個(gè)相關(guān)的基因的外顯子和±10 bp側(cè)內(nèi)含子進(jìn)行測(cè)序。用DNA樣本來(lái)制備捕獲的目標(biāo)基因文庫(kù)，然后在NEXTSEQ500測(cè)序器中對(duì)DNA文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序。也可以用通用引物對(duì)線(xiàn)粒體（mt）16S rRNA基因進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)使用Illumina高通量測(cè)序方法進(jìn)行測(cè)序。總而言之，許多研究結(jié)果證明了這些靶向高通量測(cè)序方法的潛力，它可以全面描述測(cè)序出的基因組數(shù)據(jù)，并建立數(shù)據(jù)庫(kù)，為開(kāi)發(fā)更好地基于數(shù)據(jù)做出的策略以及在重要遺傳疾病的預(yù)防方面作出更大的貢獻(xiàn)。

2.2 遺傳分析與分子診斷

2.2.1 疾病的遺傳變異分析

在對(duì)高通量測(cè)序應(yīng)用數(shù)據(jù)的分析中，經(jīng)常出現(xiàn)一些關(guān)鍵問(wèn)題。最重要的一個(gè)問(wèn)題是如何處理罕見(jiàn)的序列變異，這可能是了解重要的個(gè)體病人的疾病的發(fā)病機(jī)理、預(yù)后或治療的關(guān)鍵一步。但首先，在分析可能與人類(lèi)疾病相關(guān)的基因組序列變異之前，我們必須先對(duì)健康人群的遺傳變異有一個(gè)基本的了解。最近，1 000個(gè)基因組計(jì)劃的試驗(yàn)階段發(fā)現(xiàn)低頻序列變異，并調(diào)查更罕見(jiàn)的變異，特別是外顯子。而后，公布的數(shù)據(jù)從個(gè)體人類(lèi)基因組序列和1 000人基因工程的初步結(jié)果，顯示支持先前估計(jì)的人類(lèi)基因組變異的頻率位置。這些數(shù)據(jù)大大提升了我們對(duì)序列變異的類(lèi)型和分布的理解。

2.2.2 來(lái)自高通量測(cè)序的分子診斷見(jiàn)解

人類(lèi)可能至少有5 000～6 000個(gè)單基因疾病，目前大約有4 000種疾病與OMIM（在線(xiàn)孟德?tīng)栠z傳數(shù)據(jù)庫(kù)）中已知的基因變化有關(guān)。目前利用HTS發(fā)現(xiàn)致病突變的速度表明，在未來(lái)幾年內(nèi)，將確定導(dǎo)致許多其他疾病的突變序列。這些發(fā)現(xiàn)可能會(huì)促使疾病的重新分類(lèi)，或者促使我們更好地理解疾病的臨床癥狀。目前外顯子組測(cè)序已經(jīng)成功地在發(fā)現(xiàn)基因病上發(fā)揮較大作用。

3 高通量測(cè)序在各種疾病分子診斷中的應(yīng)用現(xiàn)狀分析

3.1 高通量測(cè)序技術(shù)闡明心血管疾病的分子途徑

HTS有潛力在心血管研究中發(fā)揮重要作用，因?yàn)樵S多疾病具有未知的潛在遺傳成分。例如，心律失常性右心室發(fā)育不良/心肌病（ARVD/C）是由橋粒相關(guān)突變引起的。雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種基因突變導(dǎo)致ARVD/C，但只有50%～60%的ARVD/C患者發(fā)現(xiàn)潛在的基因突變。此外，ARVD/C的一些臨床表現(xiàn)與Brugada綜合征非常相似。而全基因組和外顯子組測(cè)序使我們發(fā)現(xiàn)以前未知的導(dǎo)致心血管疾病的突變，并有助于區(qū)分具有非常相似臨床表現(xiàn)的不同疾病。

高通量測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步使心臟發(fā)育和疾病過(guò)程的表征更加準(zhǔn)確和全面。隨著不同平臺(tái)對(duì)HTS應(yīng)用程序的改進(jìn)，將為生物過(guò)程的功能提供更完整的分子圖像。這對(duì)我們找尋心血管疾病更安全、更有效的治療方法有很大幫助。HTS技術(shù)的實(shí)施將在確定心血管疾病發(fā)展和疾病的分子通路方面具有不可估量的價(jià)值。

3.2 采用靶向高通量測(cè)序?qū)χ橇φ系K進(jìn)行分子診斷

智力障礙（ID）是一種常見(jiàn)的神經(jīng)發(fā)育障礙，在兒童和青少年中發(fā)病率為1.5%～2%。分類(lèi)智力障礙（ID）的特征是極端的遺傳異質(zhì)性。但幾百個(gè)基因與單基因形式的ID相關(guān)，這大大增加了分子診斷的復(fù)雜性。Claire Redin和他的團(tuán)隊(duì)鑒定了26個(gè)致病突變中的16個(gè)，常染色體顯性基因中的10個(gè)新生突變。其中，一些基因多次出現(xiàn)，表明它們更頻繁地與ID相關(guān)條件對(duì)應(yīng)。

結(jié)果表明，靶向測(cè)序的診斷率為25%。在這些患者中，不論其認(rèn)知障礙的嚴(yán)重程度如何，有25%的患者都檢測(cè)到一種因果突變。這項(xiàng)工作表明，靶向測(cè)序方法在診斷ID方面是高效的，也將有助于我們更好地了解ID和自閉癥中涉及的許多基因的具體功能。

3.3 采用高通量靶向測(cè)序?qū)Ρ奖虬Y和四氫生物堿缺乏的高苯丙氨酸血癥進(jìn)行分子診斷

苯丙酮尿癥（PKU）和四氫生物堿缺乏的高苯丙氨酸血癥（BH4DH）的遺傳診斷，曾經(jīng)依賴(lài)于掃描已知突變的方法或使用Sanger測(cè)序的一些費(fèi)力的分子工具。目前，Daniel Trujillano和他的團(tuán)隊(duì)實(shí)現(xiàn)了一種基于4個(gè)基因的高通量多靶點(diǎn)重測(cè)序的新型高效策略，當(dāng)這些基因受到功能缺失突變的影響時(shí)，就會(huì)導(dǎo)致PKU和BH4DH。他們已經(jīng)在95個(gè)樣本中驗(yàn)證了這一方法，檢測(cè)樣本中所有已知的致病突變。然后，使用MiSeq測(cè)序儀對(duì)11例無(wú)特征的HPA患者進(jìn)行了相同的捕獲分析。他們的研究證明了高通量靶向重測(cè)序已準(zhǔn)備好替代經(jīng)典分子方法來(lái)進(jìn)行BH4DH的鑒別遺傳診斷，允許在出生后幾天內(nèi)建立專(zhuān)門(mén)定制的治療，有很高的使用價(jià)值。

4 問(wèn)題及展望

高通量測(cè)序方法具有成本低、診斷速度快、精度高等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)可以檢測(cè)到大量的突變，通常也可以做出精確的分子診斷，然而，基因測(cè)序作為一個(gè)領(lǐng)域還不夠成熟，面臨著更多的技術(shù)挑戰(zhàn)。例如，為了使測(cè)序在臨床中得到更廣泛的應(yīng)用，準(zhǔn)確性是至關(guān)重要的，可能會(huì)存在一些數(shù)據(jù)的可用性和能力之間的差距。這一差距可能需要更好的算法來(lái)糾正閱讀錯(cuò)誤，并借助先進(jìn)的分子生物學(xué)技術(shù)。

因此，HTS基因檢測(cè)是診斷設(shè)備的強(qiáng)大補(bǔ)充，但可能不會(huì)完全取代目前的大多數(shù)診斷方法。將高通量DNA測(cè)序數(shù)據(jù)集納入患者的臨床護(hù)理還需要一段過(guò)渡期，在此期間，臨床決策將僅基于對(duì)已知重要性的序列變異的可靠解釋。盡管這一知識(shí)體系已經(jīng)變得復(fù)雜而詳細(xì)，但迄今為止通過(guò)高通量靶向測(cè)序方法幾乎在所有醫(yī)學(xué)領(lǐng)域取得的重大發(fā)現(xiàn)，可能只是對(duì)未來(lái)的一瞥。

［1］張坡，李茜，朱艷，等.靶向捕獲高通量測(cè)序技術(shù)在遺傳性疾病分子診療中的應(yīng)用［J］.中國(guó)婦幼保健，2019，34（10）：2313-2315.

［2］鮑蕓，肖艷群，王華梁.高通量測(cè)序技術(shù)在五類(lèi)疾病分子診斷中的應(yīng)用及質(zhì)量管理策略［J］.中華臨床實(shí)驗(yàn)室管理電子雜志，2018，6（2）：69-73.

R440

A

10.15913/j.cnki.kjycx.2020.12.071

2095－6835（2020）12－0160－02

張閆佳（1999—），女，河南輝縣人，河南師范大學(xué)2017級(jí)生物科學(xué)專(zhuān)業(yè)在讀本科生。

〔編輯：王霞〕