可構建不同三維微環境的細胞培養芯片設計與制作*

陳淑豪，劉 沖，丁來錢，何玫娟，李經民※

（1.大連理工大學機械工程學院，遼寧大連 116024；2.大連理工大學遼寧省微納技術及系統重點實驗室，遼寧大連 116024）

0 引言

細胞是生命體的基本單元，細胞層面的各類研究在探尋生命規律、研究疾病病理、藥物開發及篩選等方面有不可或缺的價值[1]。細胞培養作為生命科學領域中最重要的研究技術，關鍵在于如何在體外構建與在體細胞生存環境相似的微環境[2-3]。已有大量研究表明細胞生存的三維微環境中各種細胞因子、神經遞質、細胞之間及細胞與細胞外基質（Extracellular matrix，ECM）相互粘附作用中的多種信號積極參與了調節細胞生長、分化、繁殖及凋亡等生命活動[4-5]。

近年來，微流控技術快速發展，被廣泛應用于細胞研究。微流控芯片憑借其體積小、高通量、試劑消耗少、樣本量需求小等優越性能，可對細胞進行二維或三維培養[6]。相比二維環境，三維培養能更真實還原細胞的生長特性和行為表現[7]。三維細胞培養微流控芯片設計已成為當前的研究熱點。Benjamin等[8]設計了一種三層微流控裝置用于模擬腫瘤細胞穿過血管的過程。裝置中層的微孔parylene膜能模擬血管壁的支撐結構，并對其進行水凝膠處理為細胞提供三維生長環境。Carlos 等[9]設計的微流控裝置能對3D-ECM 水凝膠進行圖案化，通過建模分析了微器件中集成三維凝膠的微結構尺寸，并觀察了三維空間中乳腺癌細胞受巨噬細胞影響的表型。Ioannis 等[10]開發了一種基于微流控技術的構建三維血管界面的方法，觀察腫瘤轉移時內皮屏障功能。芯片中引入生物水凝膠形成三維的觀測界面。劉軍山等[11]制作并驗證了一種用于細胞三維培養的集成微柱陣列的微流控芯片，對微柱間距進行了優化設計。Supriya 等[12]開發的三維細胞培養微流控平臺可以研究腫瘤與內皮細胞之間的雙向串擾。綜合分析各種三維細胞培養微流控器件，微柱結構包裹ECM模擬材料（如鼠尾膠原），能在相鄰微空間實現生物化學信息交流，適用于模擬在體微環境下的細胞生長。但芯片的微結構設計對ECM 水凝膠包裹效果的影響，以及芯片設計在構建仿生三維微環境和構建用于對比的不同微環境的研究仍有待完善。

本文設計了一種可建立不同三維微環境的細胞培養微流控芯片。在建模仿真優化芯片微結構設計的同時，對細胞培養池兩側形成的不同小分子濃度分布微環境進行了實驗驗證。所設計的芯片能為細胞與微環境相互作用機制的研究提供一個新的技術平臺。

1 芯片設計及仿真分析

1.1 芯片整體結構設計

本文設計的三維細胞培養微流控芯片如圖1 所示。芯片選用聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxane，PDMS）制作成型，PDMS具有良好的生物相容性和透氣性，適合作為細胞培養的基底材料，且其透光性好便于觀察細胞生長的狀態[2]。芯片由下層結構片和上層蓋片組成，芯片的微結構主要包括細胞培養池、3D-ECM 水凝膠微通道、微柱和培養液微通道。在細胞培養池兩側設計具有間隙的微柱結構，使細胞培養池與兩側并置凝膠通道形成連續界面，允許細胞和旁通道微空間相互作用。芯片中心微通道上串聯3 個寬度600 μm 的圓形細胞培養池，樣本能以高密度植入培養池從而增大樣本數。兩側結構呈對稱設計，向外依次為凝膠微通道和最外側培養液微通道，寬度均為400 μm。水凝膠可以獨立地填充至2 個凝膠微通道，封裝在局部微柱中從而建立三維環境。通過調整最外側溶液成分可調節小分子擴散下微環境狀態。此外，芯片微柱結構的形狀設計影響水凝膠封裝的性能，研究分析了不同微柱對封裝3D-ECM 水凝膠的效果從而優化芯片設計。確定微柱為直徑150 μm 的圓形結構，間隙為50 μm；凝膠微通道寬度為400 μm，高150 μm。

圖1 微流控芯片結構示意圖

1.2 微柱結構仿真優化

為實現在芯片上建立模擬在體3D-ECM 的空間環境，在芯片中引入生物水凝膠材料（如鼠尾膠原）。芯片中帶間隙的微柱結構的設計影響區域圖案化水凝膠的效果。水凝膠溶液在微柱間隙的封裝由前進界面的壓力差決定，根據Younglaplace方程（方程表明，氣液壓力差是表面張力和界面曲率的函數）可計算溶液界面壓力差[9]，如下所示：

式中：γ 為溶液的表面張力；θs為液體與側壁的前進接觸角；θv為液體與上下壁的前進接觸角；w和h分別為微通道的寬度和高度。

圖2 模擬膠原溶液注入的幾何模型

水凝膠溶液注入過程中與微柱側壁的接觸角隨著微柱形狀變化而改變，在此對梯形、六邊形、八邊形和圓形（外接圓直徑均為150 μm）微柱封裝性能進行仿真分析。由于芯片設計在高度方向結構一致，可對水凝膠注入微通道建立二維模型進行模擬仿真，圖2所示為基本的梯形模型，箭頭方向表示水凝膠溶液的入口和出口，梯形側邊AB范圍內分析水凝膠的封裝效果。根據水凝膠注入的微通道尺寸變化的影響[9]，選定微通道寬度為400 μm。根據對微柱間隙的相關研究[11]，微柱間隙設定50 μm。用Comsol 5.3兩相流-水平集物理場，模擬膠原溶液注入具有不同微結構芯片的過程。

仿真參數設置如下：（1）膠原溶液濃度為1 mg/mL，用流變儀測得的黏度為0.036 Pa·s，用液滴形狀分析儀測得的表面張力系數為0.060 N/m；（2）選定水凝膠溶液入口，設定入口壓力1 000 Pa；選定出口，設定出口壓力為0；（3）濕潤壁接觸角設置為41°，芯片的制作工藝中采用氧等離子表面處理鍵合兩層PDMS，也對微通道親疏水性進行改性，用液滴形狀分析儀測得膠原溶液與改性后的PDMS 接觸角為41°；（4）細化網格，使用瞬態求解器計算水凝膠注入不同微結構的封裝效果。結果如圖3 所示，水凝膠溶液在110 ms 可注滿模型，相比梯形微柱間隙溶液已經有溢出，圓形微柱溶液界面未越過間隙。此外圓形微柱能長時間保持溶液界面不溢出間隙，對水凝膠溶液的封裝效果最佳。

圖3 不同形狀微柱封裝效果仿真結果對比

1.3 芯片兩側構建不同微環境的仿真分析

細胞生長的微環境中，控制周圍可溶性小分子濃度梯度，對于研究生物化學信號誘導生物反應的定量關系至關重要。本文對封裝水凝膠后芯片的三維空間中小分子擴散進行三維仿真。用Comsol 5.3 仿真軟件中的多孔介質流動物理場和稀物質傳遞物理場耦合，對單培養池的模型計算分析，獲得了小分子濃度隨時間變化的分布。仿真參數設置如下：（1）外側旁通道流動類型為層流，封裝水凝膠的微通道流動類型為多孔介質流，壁面無滑移；（2）多孔基體滲透率為2×10-9m2，孔隙率為0.98（排液法測得）；（3）外側培養液兩通道入口速度為2 μL/min，出口處抑制回流且出口壓力為0；（4）葡萄糖作為培養基中的主要營養物質，在此用葡萄糖來代表微環境中小分子物質，兩個培養液微通道入口濃度分別設為50 mmol/L（高糖）和10 mmol/L（低糖），葡萄糖擴散系數為0.96×10-9m2/s（37 ℃）。

分析結果如圖4 所示。在微流控芯片中，并置微通道的連續界面上（如截線）可以生成介于外側培養液通道葡萄糖濃度之間的濃度梯度，如圖4（a）所示。截線處的連續界面上，葡萄糖濃度梯度隨時間發生變化，如圖4（b）所示，芯片內2 h可以形成較穩定的濃度分布，保證了芯片內微環境的穩定性。在培養池兩側的水凝膠微空間中構建了兩種不同的小分子濃度刺激（圖4（b）虛線標記處），形成了兩種不同的微環境。在培養池中三維培養細胞，可在培養池兩側的連續界面中對比研究不同微環境下的細胞生長特性。

圖4 芯片微環境的生化因子濃度變化分析

2 實驗與結果

2.1 微流控芯片制作

該微流控芯片采用澆注成型的方法制作。制作過程：（1）利用微加工技術制作模具，模具的制作工藝流程如圖5所示；（2）澆注PDMS 溶液，80 ℃下固化2 h 后拔模；（3）用等離子體清洗機對PDMS下層結構片和上層蓋片進行氧等離子體處理，對準鍵合完成芯片制作，芯片實物如圖6所示。

圖5 芯片結構片的制作工藝流程

圖6 芯片實物圖

圖7 芯片內水凝膠的封裝

2.2 芯片三維微環境構建驗證

2.2.1 水凝膠封裝實驗

對優化設計的微流控芯片注入Ⅰ型膠原溶液，驗證芯片微結構的封裝性能。稀釋5 mg/mL膠原溶液為1 mg/mL，稀釋溶液為0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液（PBS），并加入0.1 mol/L 的NaOH 溶液調節pH 值至中性。使用移液槍將30 μL 膠原溶液注入微通道入口。在工具顯微鏡下實驗驗證了圓形微柱的水凝膠封裝效果最佳，將膠原溶液灌注至芯片的水凝膠微通道，5 s可注滿單個微通道，且在微柱間隙產生穩定的氣液界面。水凝膠封裝在微柱區域且放置長時間不會溢出，如圖7所示，紅色染料染色水凝膠便于觀察。

2.2.2 不同三維微環境建立驗證

圖8 小分子擴散實驗平臺

為了研究芯片中細胞培養池兩側形成的微環境分布，對完成封裝凝膠的芯片進行小分子擴散實驗。實驗中用熒光素鈉（擴散系數0.36×10-9m2/s）模擬生化因子，與葡萄糖的擴散速度相近。利用倒置熒光顯微鏡搭建實驗平臺，如圖8所示。控制微注射泵加壓同時驅動芯片外側2個旁通道的熒光素溶液流動，形成穩定的層流狀態，流速為2 μL/min。2個旁通道中以濃度比5∶1的熒光素鈉溶液進行第1組實驗，其中高濃度一側熒光素濃度為50 μmol/L。設置顯微鏡每隔5 min拍照一次，實驗記錄了兩側三維凝膠通道的熒光擴散狀態，從而進行兩側水凝膠空間微環境對比。此外，調整熒光素鈉濃度比2∶1進行第2組實驗，高濃度一側熒光素濃度為40 μmol/L。

熒光素鈉在芯片三維空間擴散如圖9所示。利用Matlab軟件對熒光圖像進行處理，表征熒光素鈉在膠原水凝膠微環境分析區域（圖9（a）標記處）的擴散情況。芯片中熒光素分子可在2.5 h擴散穩定，形成了穩定的濃度梯度。在同組實驗中，對稱2 個水凝膠旁通道可形成兩種不同濃度的穩定微環境，如圖9（b）所示。第1 組實驗結果顯示，在兩側的三維基質空間形成了差距較大的高低兩種穩定的小分子濃度分布；第2組實驗在兩側三維基質環境中減緩了濃度差距，也形成了不同的穩定小分子濃度環境。這實現了芯片中培養池兩側不同小分子濃度微環境的控制。

圖9 芯片微環境內熒光素濃度表征

3 結束語

本文設計了一種能構建不同三維微環境的細胞培養微流控芯片。通過建模仿真優化了芯片結構設計，確定了圓形微柱用于封裝水凝膠，并模擬兩個三維基質空間中的小分子擴散分布。利用微加工工藝制作芯片，并驗證了芯片封裝水凝膠構建三維微環境的效果。設計實驗驗證了芯片內部建立擴散小分子高低兩種濃度的微環境，通過調節不同的外側培養液組分可控制多種穩定微環境的形成。芯片可用于體外模擬細胞生長與微環境相互作用的各種分析研究。