數控剪應力微流裝置評價新加達原散對MRSA生物膜的影響

石巖 齊文升

摘要 目的：通過XTT法和微流體系統觀察評價新加達原散對耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌標準菌株生物膜內細菌數量生物膜形成的影響作用。方法：1）XTT法觀測空白組、萬古霉素組及新加達原散組（水提取、醇提取）對MRSA標準菌株生物膜成熟期膜內活菌的影響。2）Bioflux200系統中接種MRSA菌至觀察區，細菌生物膜形成后分別在各進孔加入一定濃度的新加達原散水提物、醇提物及萬古霉素，同時設立溶劑對照組和空白組。然后在0.5 dyne剪切力作用下連續培養30 h，觀察各組生物膜的形成情況。結果：1）XTT法觀測結果顯示，新加達原散可明顯減少形成期及成熟期MRSA生物膜膜內活菌數量。2）2種濃度新加達原散水提物、醇提物組生物膜形成面積明顯減少，空白組、溶劑對照組生物膜面積增大，萬古霉素組生物膜形成面積較前減少，但無新加達原散2組明顯。結論：新加達原散減少了MRSA生物膜膜內細菌數量。在流動狀態下，一定濃度新加達原散在剪切力的作用下可抑制MRSA生物膜的形成;Bioflux200可以用于抑制細菌耐藥中藥的療效評價。

關鍵詞 新加達原散;耐甲氧西林金黃色葡萄球菌;生物膜;XTT法;微流裝置;剪應力;濃度;評價

Abstract Objective：To observe and evaluate the effect of Xinjia Dayuan Powder on the formation of the number of bacteria in the biofilm of methicillin-resistant Staphylococcus aureus standard strains by using The XTT method and microfluidic system Methods：1）The XTT method was used to observe the effects of the blank group，vancomycin group and Xinjia Dayuan Powder group（water extraction，alcohol extraction）on the living bacteria in the MRSA standard strain biofilm at the mature stage.2）We inoculated MRSA bacteria in the Bioflux200 system to the observation area.After the bacterial biofilm was formed，we added a certain concentration of Xinjia Dayuan Powder water extract，alcohol extract，solvent control group，blank group and vancomycin to each inlet hole，and then under the action of 0.5 dyne shearing force，they were continuously cultured for 30 h to observe the formation of biofilm in each group.Results：1）XTT method showed that Xinjia Dayuan Powder can significantly reduce the number of viable bacteria in the MRSA biofilm during the formation and maturation phase.2）The area of biofilm formation in the water extract and alcohol extract group of the 2 concentrations of Xinjia Dayuan Powder decreased significantly，the area of biofilm formation in the blank group and solvent control group increased，and the area of biofilm formation in the vancomycin group decreased compared with the previous one，but not significantly different than the 2 groups of Xinjiada Yuan Powder.Conclusion：Xinjia Dayuan Powder can reduce the number of bacteria in MRSA biofilm.In the flowing state，a certain concentration of Xinjia dayuan Powder can inhibit the formation of MRSA biofilm under the action of shearing force; Bioflux200 can be used to evaluate the curative effect of antibacterial Chinese medicine.

Keywords XinJia Dayuan Power; Methicillin-resistant Staphylococcus aureus; Biofilm; XTT method; Microfluidic device; Shear stress; Concentration; Evaluation

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.20.008

抗生素耐藥性已經成為世界范圍內的一個重大公共衛生問題。[1]耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus Aureus，MASR）更是臨床上常見的耐藥細菌。CHINET[2]2017年的統計數據顯示，全國金黃色葡萄球菌耐甲氧西林菌株顯示出對整組β-內酰胺類抗生素的耐藥性。細菌生物膜是細菌在生長過程中為了適應環境而分泌出多糖基質、脂蛋白等多種物質復合的多糖復合物，是能夠粘連、纏繞并聚集不同細菌在多糖復合物內而形成的膜樣物[3]。由于MASR膜形成能力極強[4]，引起感染的特點往往為不同期交替發作、易復發以及難治愈[5]。有研究[6]發現，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的耐藥與其形成生物膜有很大相關性。本實驗研宄通過對照觀察空白組、新加達原散組（水提取和酯提取）和萬古霉素組對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌標準菌株細菌生物膜成熟期內活菌數量的影響，及數控剪應力微流裝置對4組成熟期生物膜形成動態纏繞并聚集不同細菌在多糖復合物內而形成的膜樣物影響的觀察，探究新加達原散對體外生物膜形成的影響以及膜內細菌的抑制作用。報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 MRSA（ATCC，美國，型號：43300），購自美國典型微生物菌種保藏中心，接種至LB平板，4°冰箱保存。

1.1.2 藥物 新加達原散顆粒劑：柴胡、青黛等（新綠色藥業股份有限公司提供，由中國中醫科學院廣安門醫院藥劑科對每枇煎劑樣本進行紋圖分析比照）;注射用鹽酸萬古霉素Vancomycin（ELILILLY ITALIA S.P.A，意大利，批號：C659149）;乙醇（國藥集團，批號：10009527）;胰蛋白胨、酵母提取物（Oxoid，英國，批號：1863590，1390139-02）;氯化鈉（國藥集團，批號：20180509）;XTT（SIGMA，美國，型號：X4626）;吩嗪硫酸甲酯（PMS）（SIGMA，美國，型號：P9625）。

1.1.3 試劑與儀器

1.1.3.1 試劑 LB培養基（胰蛋白胨10 mg/L，酵母提取物5 mg/L，氯化鈉10 mg/L，葡萄糖2.5 mg/L，pH 7.4～7.6，超純水配制，高壓蒸汽滅菌，4°保存）;含糖LB培養基（胰蛋白胨10 mg/L，酵母提取物5 mg/L，氯化鈉10 mg/L，pH 7.4～7.6，超純水配制，高壓蒸汽滅菌，4°保存）;磷酸鹽緩沖液（PBS）（北京索萊寶科技有限公司，批號：P1010）超純水定容2L，髙壓蒸汽滅菌，室溫保存;0.9%氯化鈉溶液（氯化鈉9 g/L。用超純水配制）;XTT溶液（將稱量好的XTT粉末加含糖LB培養基配成1 mg/mL的溶液，水浴70 ℃加熱至充分溶解實驗時現配現用，注意避光）;PMS溶液（將稱量好的PMS粉末加超純水配成3.06 mg/mL的溶液，0.22 pm微孔濾膜過濾除菌，置4 ℃冰箱避光保存）;新加達原散醇提物（精確稱量新加達原散顆粒劑，反復用乙酸乙酯溶解中藥顆粒劑，1 000 r/min離心5 min，取上清液至一燒杯;直到所收集的乙酸乙酯上清液肉眼觀為無色透明;將收集的上清液經旋蒸儀蒸干至粉末狀，用無水乙醇溶出，制成按顆粒原劑量計算為5 g/mL的濃縮液，置4 ℃冰箱保存備用）;新加達原散水提物（將上述乙酸乙酯提物余下的藥液用水充分溶解，水溶液離心除雜質;上清液水浴蒸干后用定量的LB培養基溶解制成250 mg/mL的溶液，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌分裝入EP管內置置4 ℃冰箱保存備用）。

1.1.3.2 儀器 24孔板（康寧，美國，型號：3524），接菌環（Biologix，美國，型號：65-0001），生物安全柜（西班牙泰事達公司，西班牙，型號：BIO II Advance），恒溫恒濕培養箱（BINDER，德國，型號：KMF240），全自動八道洗板機（美國伯騰儀器有限公司，美國，型號：ELX50），分光光度計（三洋電機株式會社，日本，型號：MLS-3750），恒溫振蕩器（江蘇太倉市實驗設備，型號：THZ-D），Bioflux200型數控剪切流活細胞自動分析平臺系統（Fluxion Biosciences，美國，型號：Bioflux200）酶標儀（Bio-Rad公司，美國，型號：iMark），共聚焦激光掃描顯微鏡（Oympus公司，日本，型號：FV1000），Bio Flux WPM 48 Well Plates（Fluxion Biosciences，美國，型號：910-0003）。

1.2 方法

1.2.1 XTT法檢測藥物作用后MASR生物膜膜內形成期和成熟期活菌量 1）菌液配制：從MASR的LB培養皿上挑取單菌落置于少許LB液體培養基中，恒溫280 r/min震蕩16 h，后將菌液稀釋至OD600=0.1[7]。2）XTT法檢測：將新加達原散水提物、醇提物分別用含糖LB培養基倍，萬古霉素為溶劑1 mg/mL;乙醇稀釋濃度同醇提部分[8]。最后微孔板法檢測MRSA生物膜成熟期的活菌量，取2個96孔板，空白對照組加入如下同體積的培養液菌液和藥液（倍比稀釋法加藥[9]），37 ℃恒溫恒濕48 h后洗板機洗板后加入XTT-PMS，1.5 h后酶標儀測定OD值。

1.2.2 數控剪應力微流裝置評價藥物作用后耐甲氧西林金黃色葡萄球菌生物膜影響 1）菌液配制：方法同上。2）藥液配制：取上述實驗結果進行藥液濃度配置，將新加達原散水提物用含糖LB培養基配125 mg/mL，醇提物配成250 mg/mL;萬古霉素配成終末濃度0.08 mg/mL。空白對照（培養基）、乙醇稀釋濃度同醇提部分溶劑對照（無水乙醇）。

1.2.3 Bioflux系統下觀察藥后MRSA菌生物膜的影響 1）將Bioflux系統[10]切開孔的薄膜后，先用培養基將BioFlux Plate潤濕。于出口加入200 μL培養基。出口至入口方向加力5 dyn/cm2，5 min;靜置1 h;吸去入口及出口廢液。2）加入菌液。入口加入100 μL培養基，出口加入100 μL菌液;出口至入口方向加力2 dyn/cm2，5 s，顯微鏡下見觀察窗內布滿細菌;靜置2 h;棄去入口及出口廢液。3）生物膜培養。入口加入1 mL培養基，出口加入100 μL培養基;入口至出口方向加力0.5 dyn/cm2。于37 ℃培養30 h，每15 h更換培養基。4）分組給藥：吸去入口廢液后，分為空白組（于入口處加入1 mL培養基）、無水乙醇對照組、水溶實驗組、醇溶實驗組、萬古霉素組。在0.5 dyn/cm2下37 ℃恒溫加熱板培養。取像1 h/1次。

1.3 統計學方法 采用SPSS 20.00統計軟件進行數據分析，計量數據以均數±標準差（±s）表示，采用配對t檢驗;計數資料用百分比/率（%）表示，采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。利用Bioflux Montage圖像處理軟件的Fluorescence Adhesion以及Percent area模塊進行圖像自動分析并統計。利用Graph Pad Prism 5.0繪圖。

2 結果

2.1 微孔板法結果 與空白對照組比較，在生物膜成熟后，一定濃度的萬古霉素對MASR生物膜形成期內活菌量有作用，而新加達原散水提物在125～62.5 mg/mL濃度范圍都能顯著減少膜內活菌量，新加達原散醇提物在250～31.25 mg/mL濃度范圍都能顯著減少膜內活菌量。依據以上結果，在后續實驗中將2組新加達原散組濃度分別設定為250 mg/mL（醇提物）、125 mg/mL（水提物），萬古霉素組濃度設0.08 mg/mL。見表1，圖1。針對乙醇殺滅細菌作用考慮該溶劑對膜內細菌是否有殺滅作用進行了實驗，結果示兩者差異無統計學意義（P>0.05），提示乙醇溶劑對MASR生物膜內活菌影響不明顯。見圖2。

2.2 新加達原散對MRSA菌生物膜形成的影響 ? 利用Bioflux Montage圖像處理軟件進行圖像自動分析，空白組、無水乙醇對照組均形成了較致密的菌斑生物膜并隨時間變化生物膜面積逐漸增加。250 mg/mL新加達原散（醇提物組）、125 mg/mL新加達原散（水提物組）、萬古霉素組均有菌斑生物膜形成，給藥后隨著時間變化生物膜面積逐漸減少，其中125 mg/mL新加達原散（水提物組）細菌生物膜面積減少最為明顯，萬古霉素組生物膜面積變化較小。見圖3，表2。

3 討論

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌生物膜被視為細菌耐藥性的一種方式[11]。抗生素能夠有效殺死生長和分裂的細菌[12]。抗生素可以通過殺死自由漂浮的細菌，但通常不能根除嵌入的細菌生物膜中的細菌。抗生素階段治療后停止使用，細菌仍然可以恢復成生長狀態形成生物膜進而導致感染復發[13-14]。萬古霉素被認為是治療耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染的推薦用藥，卻具有明顯的腎毒性，不宜長期使用了[15]。生物膜中的細菌處于休眠狀態這類似于潛在的致病因素，與中醫伏邪有異曲同工之妙。吾師認為伏邪治療應從兩方面入手：1）清解：伏邪發則為溫病，故性屬熱邪，無論熱邪潛伏，還是外邪入里化熱，皆當“熱者寒之”。2）透散：邪氣內伏，宜調節氣機升降，透散外達，給邪以出路，若單用苦寒直折，易冰伏邪氣，加重病情。故創建本方，即根據中醫“伏邪”理論，由“達原飲”“升降散”“小柴胡湯”的構成，主要研究新加達原散不同于常規

圖3 給藥前后4組MASR生物膜形成變化

的治療細菌感染的清熱解毒方法。本方講求“清熱涼血、透膜散結、調節氣機升降出入”，以清透為治療大法，其組方特點和配伍方法，具備中醫理論和臨床治療特色，比西醫治療有很大的優勢和臨床價值。從我們的實驗結果來看，只有一定高濃度（臨床往往達不到）萬古霉素對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌生物膜的成熟期才有影響。新加達原散顆無論是水提取物還是乙醇提取物對成熟的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌生物膜形成有明顯的作用。體外實驗有一定局限性：1）細菌體外實驗生物膜可能不準確代表體內生物膜[16]。2）治療方案中能夠完全清除既定范圍內的所有生物膜慢性細菌感染仍有待鑒定[17]。3）新加達原散在體外和體內是否一致仍有待討論。4）本研究也只針對生物膜耐藥，不涉及其他耐藥方式。建議對生物膜成膜能力進行鑒定以及對新加達原散抑制MASR生物膜耐藥機制進一步研究，對臨床大數據的MASR臨床菌株進行實驗與試驗研究來完善新加達原飲對MASR生物膜耐藥的系統生物學研究。

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