靈芝多糖減輕蒽環(huán)類藥物所致心肌細(xì)胞凋亡的研究

徐 繁， 李 瀟， 李青山， 肖 旭， 張圣林， 姜海軍， 趙 博， 肇 爽

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院， 河北 承德 067000)

乳腺癌為女性常見惡性腫瘤，而化療為重要治療手段之一，蒽環(huán)類藥物為乳腺癌化療過程中常見藥物，以多柔比星(doxorubicin，DOX)為代表于20世紀(jì)70年代初開始應(yīng)用于臨床，但約10%的患者在停止化療近10年后還會(huì)出現(xiàn)心臟疾病，由于心肌細(xì)胞為永久性細(xì)胞，被破壞后無法再生，若心肌細(xì)胞受到損傷，可能引起一系列不良癥狀，嚴(yán)重可危及生命，蒽環(huán)類藥物致心臟毒性過程中細(xì)胞凋亡可能是其主要機(jī)制之一，而目前臨床上常用維生素C、E聯(lián)合蒽環(huán)類藥物來減輕心臟毒性，但效果欠佳，因此尋找一個(gè)方便有效的藥物成為研究熱點(diǎn)。靈芝多糖(Ganoderma lucidum polysaccharide，GLPS)是中藥靈芝的主要活性成分，具有清除氧自由基、抗肌炎、保護(hù)心臟作用，在本研究中我們用GLPS干預(yù)DOX致大鼠H9C2心肌細(xì)胞損傷，以探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料:RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)，購于HyClone Laboratories公司；Caspase-3、Caspase-8、Cleaved PARP、Bax、Bcl-2、β-actin一抗(兔來源多抗)、二抗(羊抗兔IgG HRP抗體)，購于Proteintech公司(中國武漢)；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、AV-PI檢測(cè)試劑盒購于南京建成生物工程研究所，多柔比星、靈芝多糖(純度99%)購于北京康泰合元生物公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及分組:H9C2細(xì)胞用含有10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，穩(wěn)定后調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個(gè)/mL，將細(xì)胞分為5組，分別為：對(duì)照組、GLPS高劑量組、DOX組、GLPS低劑量+DOX組，GLPS高劑量+DOX組。細(xì)胞處理方法：對(duì)照組細(xì)胞只加培養(yǎng)基，GLPS高劑量組加入100ug/mL的GLPS與H9C2細(xì)胞共培養(yǎng)8h；GLPS低劑量+DOX組、GLPS高劑量+DOX組細(xì)胞分別加入50ug/mL、100ug/mL的GLPS與H9C2細(xì)胞共培養(yǎng)8h，然后在兩組均加入1μM多柔比星繼續(xù)共培養(yǎng)24h；DOX組細(xì)胞僅加入1μM多柔比星共培養(yǎng)24h，收集各組細(xì)胞待用。

1.3AV-PI法檢測(cè)H9C2細(xì)胞凋亡:收集各組細(xì)胞重懸于0.3mL結(jié)合緩沖液中,加入5μl Annexin V-FITC和10μl碘化吡啶(PI)染液, 混勻, 室溫避光孵育30min，將每管用緩沖液補(bǔ)足至500ul后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況。

1.4Western blot分析:收集各組細(xì)胞，使用BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，取20ul蛋白，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，將已分離的蛋白轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜，室溫封閉1h，分別加入Caspase-3、Caspase-8、Cleaved PARP、Bax、Bcl-2、β-actin一抗(用一抗稀釋液將一抗按照1：1000稀釋)4℃孵育過夜，再分別加入二抗(用二抗稀釋液將二抗按照1：2000稀釋)室溫下2h，采用二氨基聯(lián)苯胺顯色, 進(jìn)行灰度分析。

2 結(jié) 果

2.1H9C2細(xì)胞的凋亡率:AV-PI雙染流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，GLPS高劑量組與對(duì)照組相比細(xì)胞凋亡率無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；DOX組細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組相比升高42.98%(P<0.05)；與DOX組對(duì)比，50ug/mL和100ug/mL的GLPS預(yù)處理H9C2細(xì)胞，凋亡率分別降低6.22%和15.36%(P<0.05)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見圖1。

圖1 各組細(xì)胞凋亡率

2.2Western blot 法檢測(cè)各組凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平:DOX組H9C2細(xì)胞Caspase-3、Caspase-8、cleaved PARP蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組，Bcl-2/Bax比值明顯低于對(duì)照組；GLPS低、高劑量+DOX組H9C2細(xì)胞Caspase-3、Caspase-8、cleaved PARP蛋白表達(dá)明顯低于DOX組，Bcl-2/Bax比值明顯高于DOX組。見圖2。

圖2 (A)H9C2細(xì)胞Caspase-3、Caspase-8、cleaved PARP蛋白表達(dá)；(B)H9C2細(xì)胞Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)；(C)各組H9C2細(xì)胞中Caspase-3、Caspase-8、cleaved PARP相對(duì)表達(dá)量；(D)各組H9C2細(xì)胞中Bax / Bcl-2蛋白表達(dá)水平比值的統(tǒng)計(jì)圖

3 討 論

蒽環(huán)類藥物為臨床常用抗腫瘤藥物，而多柔比星為蒽環(huán)類藥物的代表藥物之一，其對(duì)心肌組織具有強(qiáng)力親和性，引起心臟疾病，可能機(jī)制為藥物進(jìn)入心肌組織后使氧自由基堆積，抑制核酸及蛋白質(zhì)合成，加速心肌細(xì)胞凋亡[1]，而如何將藥物所致心臟毒性降到最低成為研究熱點(diǎn)。靈芝中含有400多種不同活性物質(zhì)，而靈芝多糖是其中質(zhì)量比重最大的成分，近幾年來對(duì)其研究眾多。已有報(bào)道，靈芝多糖具有抗氧化、抗腫瘤、保護(hù)心臟等作用，但是否可緩解藥物所致心臟毒性尚無報(bào)道。本研究采用GLPS預(yù)處理后用DOX誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷，明確其功效。結(jié)果表明DOX可以增加大鼠心肌細(xì)胞凋亡，而靈芝多糖預(yù)處理后，心肌細(xì)胞凋亡率及促凋亡蛋白表達(dá)明顯降低，抗凋亡蛋白表達(dá)率明顯升高，提示我們，GLPS在一定程度上可以減輕DOX所致的心肌損傷，具有保護(hù)心肌的作用。

氧化應(yīng)激會(huì)使ROS過多積累在細(xì)胞內(nèi)，過量的ROS可損傷線粒體，從而介導(dǎo)線粒體凋亡途徑；本實(shí)驗(yàn)之前預(yù)實(shí)驗(yàn)部分結(jié)果提示DOX干預(yù)后心肌細(xì)胞內(nèi)ROS及細(xì)胞凋亡率顯著升高，考慮DOX可使氧自由基生成增多，致細(xì)胞凋亡率升高，而GLPS可對(duì)此過程產(chǎn)生部分緩解作用。

caspase家族蛋白是死亡受體途徑(細(xì)胞外途徑)和線粒體途徑(細(xì)胞內(nèi)途徑)的共同終末途徑[2]。Caspase-3是執(zhí)行細(xì)胞凋亡的核心步驟，cleaved PARP是細(xì)胞凋亡的標(biāo)志，Caspase-8是啟動(dòng)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵。Bax和Bcl-2是Bcl家族成員，促凋亡蛋白Bax與抗凋亡蛋白Bcl-2的比值對(duì)凋亡途徑起重要調(diào)控作用[3,4]。Bcl-2/Bax比值的增加能夠激活下游細(xì)胞凋亡過程中關(guān)鍵的執(zhí)行分子之一Caspase-3的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[5]。與此一致，我們發(fā)現(xiàn)GLPS預(yù)處理8h后下調(diào)了Caspase-3、Caspase-8、cleaved PARP的表達(dá)，Bcl-2/Bax表達(dá)率明顯升高。綜上說明,靈芝多糖可能通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白,抑制活化后的caspase-3酶解切割PARP得到cleaved PARP,抑制DOX所致心肌細(xì)胞凋亡，對(duì)心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用。

綜上所述，靈芝多糖可以減輕蒽環(huán)類藥物所致心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生,發(fā)揮保護(hù)心肌細(xì)胞的作用,然而這僅僅是眾多機(jī)制中的一個(gè)環(huán)節(jié),為針對(duì)多因素綜合干預(yù)的藥物或方法的研究提供一定的理論基礎(chǔ)。