甲基丙烯酸甲酯對大鼠外周神經痛行為學影響的研究

首都醫科大學良鄉教學醫院（102401）鄧介超 史宗新

首都醫科大學附屬北京友誼醫院（100050）包利 陳浩 賈璞 唐海

經皮椎體成形術（percutaneous vertebro plasty，PVP）及在其基礎上發展而來的經皮椎體后凸成形術(percutaneous kyphoplasty, PKP)是目前骨質疏松性椎體壓縮骨折的首選治療方法。目前普遍認為椎體成形術鎮痛機制主要與三方面相關：①骨水泥注射進椎體后增強椎體強度，穩定了骨折。②骨水泥凝固過程中產熱，椎體內神經受到熱損傷后壞死。③骨水泥單體毒性導致骨內神經疼痛敏感性下降。目前尚無骨水泥單體對骨內神經疼痛敏感性影響的研究。

本實驗按照目前常用的動物疼痛模型的建立方法，建立SD大鼠MMA疼痛模型。將不同濃度的MMA注射至大鼠足底皮下，在注射前和注射后不同時間點觀察自發痛現象，并測定爪體積和機械痛敏的變化。用布比卡因和A-317491對MMA給藥部位進行局部阻滯，以鑒別MMA對痛敏的影響是否是通過作用于外周神經發揮作用。為驗證骨水泥單體毒性導致骨內神經疼痛敏感性下降而在椎體成形術鎮痛機制中發揮作用的觀點提供依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動物來源及標準 實驗動物為健康雌性SD大鼠，體重200～220g，均由軍事醫學科學院實驗動物中心提供。

1.1.2 試劑及器械 MMA（stryker，US.），布比卡因（上海和豐制藥有限公司），A-317491（Sigma，US.）。Von Frey Hair測量機械痛敏，體積測量儀(UGO BASILE，Italy)測量大鼠爪體積。

1.2 方法

1.2.1 動物飼養及分組 大鼠每籠3只，室溫23℃～24℃，晝夜循環12/12h，自由攝水攝食。①生理鹽水對照組、MMA濃度2μL/ml、10μL/ml、50μL/ml、200μL/ml、500μL/ml每組各6只。②利多卡因阻滯10μL/ml MMA：分為MMA給藥前抑制和給藥后抑制兩組各6只；A-317491阻滯10μL/ml MMA：分為MMA給藥前抑制和給藥后抑制兩組各6只。

附表1 NS對照組與不同濃度MMA對大鼠機械痛敏的影響（±s,g）

附表1 NS對照組與不同濃度MMA對大鼠機械痛敏的影響（±s,g）

組別 給藥前給藥后時間1h 1h 2h 3h 4h 1d 2d 3d 4d 7d 10d 12d 14d 21d NS對照組 12.1±0.8 12.6±0.5 12.3±1.0 12.3±0.9 12.2±1.1 12.4±1.2 12.8±1.3 12.6±1.2 13.0±1.0 12.2±0.8 12.3±0.7 12.5±0.7 12.8±0.8 12.5±0.9 2μl/ml 13.2±1.4 8.4±1.6 7.7±2.0 7.8±1.3 8.7±0.7 9.9±1.0 10.5±0.8 10.9±1.3 12.1±1.4 12.7±1.5 13.1±1.3 13.1±1.3 13.1±1.5 13.3±1.3 10μl/ml 12.6±0.8 6.0±3.7 3.7±2.6 3.7±2.6 4.7±3.0 5.6±2.8 6.0±2.7 5.3±1.0 5.1±1.8 6.9±2.0 8.5±0.7 8.8±0.9 10.2±1.8 12.1±1.4 50μl/ml 12.0±0.9 18.5±1.7 9.2±2.7 9.2±2.7 7.4±2.5 9.2±0.9 8.7±0.6 8.7±0.9 7.4±0.7 8.3±1.1 10.0±0.7 11.3±0.8 1.8±1.0 12.2±0.9

附表2 布比卡因和A-317491對機械痛敏的抑制和翻轉效應（±s,g）

附表2 布比卡因和A-317491對機械痛敏的抑制和翻轉效應（±s,g）

組別 給藥前給藥后時間1h 1h 2h 3h 4h 1d 2d 3d 4d 7d 10d 12d 14d 21d布比卡因抑制組 12.1±1.4 10.1±1.6 10.5±2.0 10.4±1.3 11.0±0.7 8.2±1.0 8.9±0.8 8.6±1.3 9.0±1.4 9.5±1.5 10.2±1.3 11.0±1.3 12.0±1.5 12.0±1.3布比卡因翻轉組 12.3±0.8 12.0±1.7 11.5±1.4 11.2±2.2 11.0±2.0 9.9±1.8 9.1±1.7 9.7±1.0 10.0±1.8 12.7±1.5 13.1±1.3 12.0±0.9 12.2±1.8 12.4±1.1 A-31749抑制組 12.4±0.9 10.0±1.7 9.8±1.8 10.1±2.7 9.5±2.5 8.6±0.9 7.0±0.6 7.7±0.9 7.8±0.6 7.7±1.1 10.0±0.7 8.8±0.9 12.0±0.8 12.3±0.9 A317491翻轉組 12.0±0.9 11.5±1.7 10.7±1.8 10.2±2.7 9.5±2.5 8.5±0.9 8.0±0.6 8.6±0.9 8.4±0.7 9.5±1.1 10.0±0.7 11.5±0.8 12.1±1.0 11.9±0.9

1.2.2 行為學觀察 將30cm×30cm×30cm的透明有機玻璃箱置于50cm高的鐵架上，鐵架底部為鐵絲網,網孔大小為0.5cm×0.5cm。實驗前2天，每天將動物放入實驗箱中適應2h，使之適應環境。在大鼠左側后足底中心皮下注入不同濃度的MMA，每次注射20μL，注射后立即將大鼠放回實驗箱開始計時。觀察并記錄1h、2h、3h、4h及1d、2d、3d、4d、7d、10d、12d、14d、20d的機械痛閾。將von-Frey纖維通過鐵絲網格刺激給藥側足底中心部位，刺激強度由小到大，每個強度重復刺激3次(每次間隔3min)，直至出現縮足反射，將出現縮足反射的強度作為機械痛閾值。連續測量3次取平均值。

用標記筆在大鼠左后足掌底皮膚與毛交界處作標記，作為每次浸入水中的深度的標準(液平面恰與左后足的標記線重疊)，記錄體積測量儀顯示的數據。放下大鼠，擦干左后足，至少間隔10秒鐘再進行第2次測量，測3次取平均值。

2 結果

本次實驗結果中，不同濃度MMA對大鼠機械痛敏的影響詳見附表1。布比卡因和A-317491對機械痛敏的抑制和翻轉效應詳見附表2。

2.1 給藥前1h機械痛敏差異分析 所有大鼠給藥前測定機械痛敏的結果：方差分析示為正態性（P=0.121＞0.05），具有方差齊性，且差異無統計學意義（P=0.179＞0.05）。

2.2 NS對照組機械痛敏差異分析 空白對照組給予生理鹽水20μl足底皮下注射，不同時間點測得機械痛敏無統計學差異（P=0.948＞0.05）。兩兩時間點之間比較無統計學意義（P＞0.05）。表明生理鹽水皮下注射不影響大鼠機械痛敏。如附圖1所示。

2.3 給藥后不同濃度組機械痛敏變化趨勢 2μL/ml、10μL/ml兩個濃度MMA均能顯著減低大鼠機械痛敏。在3h時間點機械痛敏達最小值，此后機械痛閾持續減低并逐漸恢復正常，在給藥后21d恢復至正常值。其中10μL/ml降低機械痛敏的效果最強。如附圖2所示。

50μL/ml濃度MMA在給藥后1h顯著升高大鼠機械痛敏，在給藥后1d開始逐漸恢復，恢復過程中出現短暫的類似2μL/ml、10μL/ml機械痛敏下降過程，在21d時機械痛敏恢復正常值。如附圖3所示。

2.4 布比卡因與A-317491對機械痛敏的抑制、翻轉效應 布比卡因是強效和長時效局麻藥，作用時間為4～6小時。在足底皮下注射MMA前10min，足底皮下注射20μL劑量的0.2%布比卡因，擬抑制MMA的降低機械痛敏效應。結果顯示，布比卡因在給藥后1h顯著抑制MMA降低機械痛敏的作用，并在給藥后1d逐漸恢復正常趨勢。如附圖4所示。

附圖1 NS對照組機械痛敏的變化

附圖2 機械痛敏在2μL/ml、10μL/ml濃度MMA作用下的變化趨勢

附圖3 機械痛敏在50μL/ml濃度MMA作用下的變化趨勢

附圖4 布比卡因對機械痛敏的抑制效應

附圖5 布比卡因對機械痛敏的翻轉效應

附圖6 A-317491對機械痛敏的抑制效應

附圖7 A-317491對機械痛敏的翻轉效應

2.5 在足底皮下注射MMA后10min，足底皮下注射20μL劑量的0.2%布比卡因，擬翻轉MMA的降低機械痛敏效應。結果顯示，布比卡因在給藥后1h顯著抑制MMA降低機械痛敏的作用，并在給藥后1d逐漸恢復正常趨勢。如附圖5所示。

2.6 在足底皮下注射MMA前10min，足底皮下注射20μg劑量的A-317491，擬抑制MMA的降低機械痛敏效應。結果顯示，A-317491在給藥后1h顯著抑制MMA降低機械痛敏的作用，并在給藥后7d逐漸恢復正常趨勢。如附圖6所示。

2.7 在足底皮下注射MMA后10min，足底皮下注射20μg 劑量的A-317491，擬翻轉MMA的降低機械痛敏效應。結果顯示，A-317491在給藥后1h顯著抑制MMA降低機械痛敏的作用，并在給藥后7d逐漸恢復正常趨勢。如附圖7所示。

3 討論

丙烯酸骨水泥自發明以來被逐步應用至骨科領域[1][2]。硬化后的丙烯酸骨水泥可以持續在長達幾周的時間內持續釋放單體[3]。椎體成形術中使用的是注射型骨水泥，單體聚合過程較普通骨水泥長，在牙膏期時注入椎體內釋放大量的單體，該濃度明顯超過細胞毒性的濃度[4]。

3.1 MMA誘發注射部位炎性水腫和縮足自發痛 外周感覺神經受損或組織受到炎癥刺激時，常出現痛覺過敏、痛覺超敏和自發痛等反應性增強或敏感化的表現。痛覺過敏是對傷害性刺激產生過于強烈的反應；痛覺超敏是對非傷害性刺激產生傷害性反應；自發痛是在沒有刺激條件下出現的自發性疼痛[5-10]。

SD大鼠足底注射20μL量200μL/ml濃度的MMA可引起注射側足明顯水腫、爪體積增大，給藥后第3天水腫消退。500μL/ml濃度的MMA可誘發明顯的持續1小時的自發縮足反射、舔足等自發痛表現，1小時后給予60g的von-Frey纖維不能誘發機械痛閾（即無法測量），并且第21天時仍無法測得機械痛閾。

3.2 MMA誘發鏡像痛 軀體一側組織或神經損傷后導致對側相對應的部位出現疼痛的現象，被稱為鏡像痛(mirror-image pain)。軀體兩側神經系統間存在相互作用既有解剖學基礎，又有生理學證據[11]。

諸多關于鏡像痛敏發生機制的研究表明，鏡像痛敏的發生是由中樞敏化過程所介導，而且中樞敏化一旦建立，就不再依賴外周傷害性信息傳入的維持[12]。根據這一理論可以推斷：①低濃度的MMA對神經產生可逆性損傷并引起原發性機械痛敏，依賴中樞敏化機制產生鏡像機械痛敏。②高濃度的MMA對神經產生不可逆的損傷，在這一過程中產生長達1小時以上的單相持續性自發痛反應，但是該自發痛行為無鏡像性。注射側足明顯水腫，在水腫消退前、消退后測量同側和對側的機械痛閾均大于60g（60g重量可將大鼠下肢抬起，即無法測得），并且在第20天仍大于60g，這樣間接證明高濃度的MMA導致足底神經纖維受到不可逆損傷。

3.3 MMA對大鼠機械痛閾的影響 MMA作用于大鼠足底神經后引起機械痛閾下降，下降程度與濃度相關，濃度越大機械痛閾越低。高濃度的MMA可誘發大鼠縮足、自噬肢體等自發痛[13-16]。

3.4 MMA對大鼠痛行為的影響是通過外周神經系統發揮作用 MMA注入之前和之后給予局部布比卡因和A-317491浸潤均可劑量依賴性地抑制MMA誘發大鼠機械痛行為反應[17-20]。

P2X3受體激活后引起疼痛反應，且對機械痛具有特異選擇性。背根神經節是外周神經與中樞神經的信號轉導中繼站，其中的小細胞與痛覺傳導有關，P2X3亞基高度選擇性的表達于處理傷害性信息的小直徑感覺神經元上[21]。

A-317491是P2X3受體選擇性拮抗劑，可有效減輕大鼠的神經病理性疼痛[22]。在慢性坐骨神經壓迫性模型中，A-317491可以完全阻止機械性疼痛和熱痛覺過敏，并能明顯減輕由弗氏佐劑和福爾馬林誘發的各種痛覺過敏反應。

研究行為藥理學用于研究炎性疼痛或病理性痛的模型的福爾馬林模型只具有雙相的自發痛表現而無熱或機械痛敏發生，辣椒素、角叉菜椒模型無穩定的持續性自發痛表現[23][24]。本實驗顯示，高濃度MMA可引起大鼠足水腫、縮足反射和自噬等自發痛反應，低濃度MMA可引起長時程單相機械痛敏下降，而無明顯的熱痛敏改變。500μL/ml以上濃度可引起大鼠注射足對測量機械痛敏的刺激無反應，21d后仍不能恢復正常值。這說明，在2～50μL/ml濃度范圍內MMA可逆性地引起外周神經機械痛敏下降，大于500μL/ml的MMA不可逆地損傷外周神經。

綜上所述，MMA對外周感覺神經纖維的影響主要是低濃度引起機械痛敏下降，高濃度不可逆地損傷神經。