血清AFP、B7-H4聯合CP檢測對原發性肝癌的診斷價值

楊改標，李 倩，李 璇，龔念婷，張勝梅

（中國人民解放軍32268部隊檢驗病理科，云南大理 671003）

原發性肝癌（primary hepatic carcinoma，PHC）是臨床常見的惡性腫瘤，在我國死亡率高達20.14∕10 萬，占全部惡性腫瘤死亡的18.18%〔1〕。臨床研究顯示，PHC 在早期無明顯癥狀，出現癥狀時已經是中晚期，錯過了最佳的手術時機〔2〕。因此，臨床對于PHC 的預警尤為重要，如何早發現、早診斷是當前醫療技術急需解決的問題。甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）是PHC 診斷中常用腫瘤標志物之一，但AFP敏感性欠佳，易造成漏診〔3〕。因此，尋找敏感性更高的腫瘤標志物及有效的診斷方法是肝癌領域的研究重點。近年來，大量學者對AFP 聯合其他血清標志物診斷PHC 進行了研究，發現相比較于單一指標，多指標聯合診斷可明顯提升診斷準確性〔4〕。協同刺激分子B7-H4 為B7 家族成員之一，可通過抑制固有免疫及T 細胞介導的免疫應答，實現對腫瘤微環境的調節作用；銅藍蛋白（ceruloplasmin，CP）由肝臟合成，可將銅從肝臟輸送到各組織加以利用，還能調節血鐵水平及清除超氧基陰離子，兩者均與肝癌的發生、發展過程密切相關，用于診斷PHC 具有一定的準確性，但是目前鮮見有關血清AFP 聯合B7-H4及CP 用于診斷PHC 的文獻報道〔5〕。基于此，本研究同時檢測PHC 患者血清AFP、B7-H4 及CP，探究三者聯合檢測對PHC 的診斷價值，為早期診斷PHC提供理論基礎。

1 資料與方法

1.1一般資料選取2017 年9 月至2018 年9 月在中國人民解放軍32268 部隊接受治療的42 例PHC患者作為研究對象，設為PHC 組，所有患者均符合《原發性肝癌的臨床診斷與分期標準》中有關PHC的診斷標準〔6〕并經影像學及病理學確診；TNM 分期：Ⅰ期11 例、Ⅱ期13 例、Ⅲ期12 例、Ⅳ期6 例。同期選取肝臟良性疾病者60例作為肝臟良性疾病組，所選患者均符合《慢性乙型肝炎防治指南》中肝臟良性疾病診斷標準〔7〕；疾病類型：肝炎患者36 例，肝硬化患者24 例。選取60 例同期健康體檢者作為對照組。三組均排除合并心、肝、腎、脾等重要器官器質性疾病及其他類型腫瘤疾病者。

1.2標本采集所有受試者采集空腹靜脈血4 mL（住院受試者在入院后第2 天采集），置于乙二胺四乙酸抗凝管中，經離心后收集血清，-20 ℃保存備用。

1.3免疫學檢測采用電化學發光法（免疫化學發光儀，A2000Plus，鄭州安圖生物技術有限公司，中國）及其配套檢測試劑盒檢測三組血清AFP 及B7-H4含量，操作方式按照說明書進行。采用免疫透射比濁法（特種蛋白儀，Immage800 型，貝克曼庫爾特有限公司，美國）及其配套檢測試劑盒檢測三組血清CP 含量。

1.4統計學方法采用SPSS 20.0 軟件分析處理數據，計量數據以（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組數據間比較采用重復測量方差分析；計數資料采用頻數表示，進行χ2檢驗；AFP 與B7-H4 及CP 相關性分析采用Pearson 法。采用受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，簡稱“ROC 曲線”）分析各血清指標診斷PHC 的價值，計算ROC 曲線的曲線下面積（area under the curve，AUC）及其95%可信區間（95%CI），如果AUC＞0.5且與AUC=0.5 相比差異具有統計學意義，則認為該診斷指標具有一定的診斷價值。在ROC 曲線上以約登指數（敏感度+特異度-1）最大的點作為截斷點，對應值為截斷值。P＜0.05 為差異有統計學意義，所有檢驗均為雙側檢驗。

2 結果

2.1三組受試者基線資料比較三組受試者性別、年齡等基線資料比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 三組受試者基線資料比較

2.2三組受試者血清AFP、B7-H4及CP含量比較PHC組患者血清AFP、B7-H4及CP含量均明顯高于肝臟良性疾病組及對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 三組受試者血清AFP、B7-H4及CP含量比較（± s）

表2 三組受試者血清AFP、B7-H4及CP含量比較（± s）

注：與PHC組比較*P＜0.05。

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2.3 ROC曲線分析血清AFP、B7-H4、CP單項檢測及聯合檢測對PHC的鑒別診斷采用ROC 曲線分析各指標對PHC 的診斷價值。結果顯示，血清AFP的AUC 為0.712，截斷值為103.78 g∕L；血清B7-H4的AUC 為0.816，截斷值為50.39 ng∕mL；CP 的AUC為0.754，截斷值為0.31 g∕L。三者聯合檢測時AUC為0.897，明顯高于三者單獨檢測時的AUC，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖1及表3。

圖1 血清AFP、B7-H4、CP及三者聯合檢測PHC的ROC曲線

表3 血清AFP、B7-H4、CP及三者聯合檢測PHC的預測價值

2.4血清AFP、B7-H4及CP之間的相關性分析相關性分析結果顯示，AFP、B7-H4 及CP 呈兩兩正相關（r=0.594、0.362、0.412，P＜0.05）。

2.5血清AFP、B7-H4及CP陽性檢出率比較三組受試者血清AFP、B7-H4及CP 陽性檢出率均存在明顯差異，差異有統計學意義（P＜0.05）。PHC組血清AFP、B7-H4及CP陽性檢出率均明顯高于肝臟良性疾病組及對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表4。

表4 三組血清AFP、B7-H4及CP陽性檢出率比較［n（%）］

2.6血清AFP、B7-H4及CP單項檢測及聯合檢測對PHC的診斷價值分析血清AFP、B7-H4及CP聯合檢測的靈敏度、特異度及準確度分別為92.86%、93.33%和93.21%，均高于各指標單項檢測時。見表5。

3 討論

PHC 是全世界最常見的消化道惡性腫瘤之一，每年的新發病率居惡性腫瘤中的第5 位，其死亡率則高居第3 位，對人類生命安全造成巨大威脅〔8〕。大部分PHC 患者在臨床確診時已是晚期，已錯過最佳治療時間，治療效果往往不理想。因此，尋找能早期診斷PHC 的指標及方法對于提升PHC 的治療效果至關重要。目前，臨床上診斷PHC 主要依靠影像學及病理學技術，但這些診斷方法對于肝內病變的良惡性鑒別較為困難，特別是PHC 與肝臟良性疾病的結節性病變難以鑒別〔9〕。研究顯示，在影像學檢測出PHC 前，腫瘤血清標志物會先出現異常變化，通過監測血清標志物變化是診斷PHC 的有效途徑〔10〕。其中，AFP 是臨床常用的PHC 血清診斷標志物，但研究顯示其診斷準確性欠佳，采用血清AFP進行診斷時，約30%的PHC 患者診斷為陰性〔11〕，而本研究也顯示采用血清AFP 對PHC 進行診斷時其AUC 僅為0.712，其檢測特異度僅為75.83%，無法滿足臨床診斷需求。因此，需要進一步尋找更有效的血清診斷標志物來提升PHC的早期診斷率。

表5 血清AFP、B7-H4及CP單項檢測及聯合檢測對PHC的診斷價值［n（%）］

B7-H4是近年來新發現的B7家族成員之一，對T細胞介導的免疫反應具有負性調節作用。既往研究顯示，B7-H4 可通過抑制固有免疫及T 細胞介導的免疫應答，在調節腫瘤微環境中扮演著至關重要的角色，可介導腫瘤疾病的發生及發展過程〔12〕。正常組織不表達或低表達B7-H4，但其高表達于腫瘤組織中，主要在腫瘤細胞及腫瘤浸潤性巨噬細胞。此外，B7-H4 還以可溶形式存在于血液中，導致卵巢癌、乳腺癌及非小細胞肺癌患者血清B7-H4水平異常升高。而本研究結果顯示，PHC 患者血清B7-H4水平明顯高于其他兩組，提示B7-H4 與PHC 的發生、發展也密切相關。覃慧敏等〔13〕研究顯示，B7-H4在早期診斷PHC 和良惡性肝硬化結節鑒別診斷方面發揮著至關重要的作用，且相關性研究還證實肝臟出現異變之前，B7-H4 即會出現明顯變化。而Huang 等〔14〕研究表明，血清B7-H4 的測定不僅在良惡性肝病的鑒別診斷及PHC 的早期診斷中具有較高的應用價值，而且可作為評估PHC 預后的可靠指標。本研究發現血清B7-H4 診斷PHC 的靈敏度高達80.95%，與上述研究一致，進一步證實其在PHC診斷中的價值。

CP 是由肝臟合成的含銅α2-糖蛋白，由細胞色素氧化酶組成，具有銅離子運輸、血液凝固、血管生成及維持鐵平衡等多種生理功能。在正常情況下，CP 由肝臟合成后，一部分經膽道排出，血清中約90%銅原子與CP結合，血清中CP含量、氧化酶活性及銅含量間處于平衡狀態〔15〕。但是，CP同時也是一種急性時相蛋白，CP的升高是機體對疾病的一種應激反應，當機體出現腫瘤、炎癥等多種病理狀態時，其血清含量將明顯提升〔16〕。毛家璽等〔17〕研究顯示，相比較于健康者，肝癌患者血清CP 明顯升高，且血清CP 含量與疾病嚴重程度顯著相關，血清CP 具備作為臨床診斷慢性乙型肝炎標志物的可能性。本研究發現，相比較于對照組及肝臟良性疾病組，PHC 組患者血清CP 水平明顯升高，提示CP 與PHC的發生、發展密切相關，與上述研究結果一致。此外，也有研究證實肝癌細胞本身存在CP mRNA，將刺激機體對CP 的進一步合成，也就是說PHC 患者血清CP 含量升高的原因不僅在于機體氧化應激的產生，還與肝癌細胞自身存在CP mRNA 有關，而這種變化提示血清CP可作為肝癌的診斷標志物〔18〕。

為了進一步明確血清AFP、B7-H4及CP診斷PHC的價值，本研究進行ROC 曲線分析。結果顯示，血清AFP、B7-H4 及CP 對于PHC 均有一定的診斷價值，但是三者單項檢測的準確度均低于90%，依然無法滿足臨床需求。近年來，大量研究顯示，相比較于單一指標檢測，多指標的聯合檢測可顯著提升疾病診斷準確度，具有更高的臨床應用價值〔19-20〕。此外，本研究結果顯示血清AFP、B7-H4 及CP 兩兩正相關，提示三者可能同時介導PHC 的發生、發展過程。AFP 是由胚肝細胞產生的一種球蛋白，在出生3 個月后達到成人水平，而當肝細胞惡化后有重新獲得合成該蛋白的能力，導致機體血清AFP 水平顯著升高。肝細胞惡化后，機體出現應激反應，作為急性時相蛋白B7-H4 與CP 會發揮免疫調節作用，其血清水平均得到明顯提升，三者相互作用，共同參與PHC 的疾病發展過程。為此，本研究采用血清AFP、B7-H4 聯合CP 檢測的方式診斷PHC，結果顯示相比較于單一指標診斷，聯合檢測時其AUC 顯著增加，診斷靈敏度、特異度及準確度也得到明顯提升，提示聯合檢測血清AFP、B7-H4 及CP 對PHC患者具有更高的診斷價值。

綜上所述，聯合檢測血清AFP、B7-H4 及CP 三項腫瘤標志物將顯著提升對PHC 的診斷準確性，降低PHC的漏檢率，可為PHC的臨床診斷提供可靠的參考依據。