不同毒力結(jié)核分枝桿菌誘導(dǎo)小鼠樹突狀細(xì)胞凋亡差異分析

李 萍，李叢哲，吳利先

（1.河西學(xué)院醫(yī)學(xué)院，甘肅張掖 734000；2.華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院兒科，河北唐山 063000；3.大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000）

結(jié)核病（Tuberculosis，TB）是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）引起的傳染性疾病，每年約有1 040 萬(wàn)新增病例，據(jù)統(tǒng)計(jì)至2019 年，其造成的死亡人數(shù)超過(guò)艾滋病和瘧疾〔1〕。約有10%結(jié)核病發(fā)展為活動(dòng)性結(jié)核，其余多處于潛伏感染狀態(tài)，通過(guò)多種機(jī)制來(lái)逃避和操縱宿主的免疫應(yīng)答〔2〕。Mtb逃避宿主天然免疫的機(jī)制包括胞漿逃逸、限制性抗菌肽的產(chǎn)生、吞噬體成熟的阻斷、細(xì)胞凋亡、自噬調(diào)節(jié)等，這些方式也限制了Mtb感染過(guò)程中適應(yīng)性免疫反應(yīng)的發(fā)展。Mtb感染很大程度上取決于與宿主固有免疫細(xì)胞早期的相互作用，參與Mtb感染的主要免疫細(xì)胞有巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）等〔3〕。DC 是連接先天免疫和適應(yīng)性免疫的重要橋梁細(xì)胞，在啟動(dòng)和調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用，參與清除Mtb。細(xì)胞凋亡是宿主抵抗病原體的重要防御機(jī)制，DC凋亡參與宿主的抗感染免疫，除了在感染早期限制Mtb的生長(zhǎng)，在誘導(dǎo)獲得性細(xì)胞免疫應(yīng)答時(shí)，一定條件下可導(dǎo)致細(xì)胞死亡，有助于殺死胞內(nèi)寄生Mtb〔4〕。了解在抗Mtb感染過(guò)程中DC的凋亡機(jī)制，對(duì)于控制Mtb的胞內(nèi)感染具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)建立了不同毒力Mtb與小鼠DC2.4混合培養(yǎng)模型，用流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）Annexin V-FITC∕PI 雙染法檢測(cè)Mtb標(biāo)準(zhǔn)株H37Ra和Mtb臨床分離株14-11感染DC2.4的凋亡情況，探討不同毒力Mtb感染誘導(dǎo)DC2.4的細(xì)胞凋亡率。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 菌株Mtb臨床分離株14-11 由大理州疾病預(yù)防控制中心提供；Mtb標(biāo)準(zhǔn)株H37Ra 由大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 細(xì)胞株 小鼠DC2.4購(gòu)自上海賽百慷生物技術(shù)股份有限公司。

1.1.3 主要試劑和儀器 RPMI Medium-1640（美國(guó)Gibco公司）；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS，蘭州百靈生物技術(shù)有限公司）；中性結(jié)核羅氏培養(yǎng)基（珠海貝索生物技術(shù)有限公司）；雙抗（北京Solarbio公司）；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS，自制）；Annexin V-FITC∕PI 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）；倒置相差顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；流式細(xì)胞分選儀（美國(guó)BD公司）。

1.2方法

1.2.1 小鼠DC2.4的培養(yǎng) 將DC2.4置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育4 h，待細(xì)胞貼壁后輕輕吸棄1∕2 培養(yǎng)基，補(bǔ)加1∕2 的RPMI-1640 完全培養(yǎng)基后吹打均勻，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)過(guò)夜，每2～3 d 傳代1 次。培養(yǎng)至第9 天時(shí)，收集培養(yǎng)皿中所有的懸浮細(xì)胞，PBS 洗 滌1～2 次，用 適 量RPMI-1640 完全培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度至終濃度為3×106個(gè)∕mL。

1.2.2Mtb的培養(yǎng)及菌懸液制備Mtb復(fù)蘇傳代，接種于羅氏固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)（約3～4 周）刮取生長(zhǎng)良好的H37Ra 菌落、14-11 菌落，用含有0.05%吐溫-80 的無(wú)菌0.9%氯化鈉溶液研磨均勻后，再用標(biāo)準(zhǔn)麥?zhǔn)媳葷峁苷{(diào)整菌液濃度為3×107CFU∕mL備用。

1.2.3Mtb感染小鼠DC2.4 混合培養(yǎng)模型制備 將小鼠DC2.4 細(xì)胞（3.0×106個(gè)∕mL）分別接種于24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔1 mL，移至37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育4 h；按照感染比10：1 每孔加入上述處理好的菌懸液3.0×107CFU∕mL，每孔1 mL；37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育，分別于混合培養(yǎng)1、3、6、12、24 h收集細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DC2.4 凋亡率 按Annexin V-FITC 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒操作說(shuō)明書操作，分別于感染后1、3、6、12、24 h 收集細(xì)胞（用不含乙二胺四乙酸的胰酶消化），1 000 r∕min 離心去上清液，PBS 洗滌2 次，各試驗(yàn)組樣品加入100 μL Binding Buffer 重懸細(xì)胞，輕輕混勻；加入5 μL Annexin V-FITC 混勻后，再加入5 μL 碘化丙啶（PI）染色液，混勻，室溫避光孵育20 min；1 000 r∕min離心10 min，棄上清液，重復(fù)洗滌1次，加入400 μL PBS重懸細(xì)胞；染色完成后1 h 內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組凋亡率。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)以（±s）表示，兩組間數(shù)據(jù)比較采用方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DC2.4形態(tài)觀察倒置顯微鏡下觀察DC2.4的形態(tài)和生長(zhǎng)，于培養(yǎng)第3 天可見細(xì)胞體積增大，向四周伸展出毛刺樣突起，呈樹根狀或多形性。小鼠DC2.4 分別與H37Ra 及14-11 混合培養(yǎng)1 h后，即有細(xì)菌侵入；培養(yǎng)3、6、12、24 h 后，倒置顯微鏡下可見細(xì)胞呈多形性；培養(yǎng)12 h 后部分細(xì)菌侵入細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)呈顆粒狀，并出現(xiàn)細(xì)胞核碎裂等形態(tài)學(xué)改變。隨著混合培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，此現(xiàn)象更加明顯。見圖1。

圖1 倒置顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)

2.2H37Ra、14-11與DC2.4混合培養(yǎng)凋亡率H37Ra 與14-11 均能誘導(dǎo)小 鼠DC2.4 凋 亡，H37Ra在感染DC2.4 1、3、6、12、24 h 后細(xì)胞凋亡率均高于14-11，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），在混合培養(yǎng)1、12 h后細(xì)胞凋亡率略高于其他時(shí)間點(diǎn)，細(xì)胞凋亡率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。未感染Mtb的小鼠DC2.4 設(shè)為對(duì)照，對(duì)照在24 h 時(shí)細(xì)胞凋亡率較高，1、3、6、12 h 時(shí)的細(xì)胞凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。Mtb感染DC2.4 細(xì)胞凋亡率曲線見圖2。

2.3不同毒力Mtb感染小鼠DC2.4后流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡率采用Annexin V-FITC∕PI 標(biāo)記法檢測(cè)不同時(shí)間段細(xì)胞凋亡情況。見圖3。使用經(jīng)凋亡誘導(dǎo)處理的細(xì)胞，作為對(duì)照進(jìn)行熒光補(bǔ)償調(diào)節(jié)去除光譜重疊并設(shè)定十字門位置。左下象限（Anˉ，PIˉ）代表正常活細(xì)胞，右下象限（An+，PIˉ）代表早期凋亡細(xì)胞，左上象限（Anˉ，PI+）代表收集過(guò)程中的損傷細(xì)胞，右上象限（An+，PI+）代表壞死細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞。右下象限（An+，PIˉ）與右上象限（An+，PI+）凋亡率之和為總凋亡率。

表1 H37Ra感染、14-11感染及對(duì)照不同時(shí)間凋亡率（±s，%）

表1 H37Ra感染、14-11感染及對(duì)照不同時(shí)間凋亡率（±s，%）

注：與對(duì)照相比*P＜0.05。

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圖2 不同毒力Mtb感染DC2.4不同時(shí)間凋亡率

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Mtb感染DC2.4凋亡率

3 討論

結(jié)核病仍然是世界范圍內(nèi)單一傳染性病原體死亡的主要原因，是全世界所面臨的難題，特別是在云南地區(qū)結(jié)核病發(fā)病率高，不同的Mtb菌株具有不同毒力及流行病學(xué)特征，為了進(jìn)一步研究更好的保護(hù)策略需要確定Mtb的免疫反應(yīng)機(jī)制。DC 是免疫應(yīng)答中重要的免疫細(xì)胞，在遞呈Mtb抗原中起著重要作用，也是連接先天免疫和適應(yīng)性免疫的重要細(xì)胞。DC 表達(dá)甘露糖受體和DC 特異性非整合素，它們能夠識(shí)別Mtb配體〔5〕。當(dāng)Mtb入侵機(jī)體后，除調(diào)動(dòng)免疫系統(tǒng)清除病原體外，宿主細(xì)胞還會(huì)通過(guò)細(xì)胞凋亡來(lái)抑制病原體的存活。細(xì)胞凋亡除了在感染早期限制Mtb的生長(zhǎng)，在誘導(dǎo)獲得性細(xì)胞免疫應(yīng)答中也起著重要作用，并在一定條件下導(dǎo)致細(xì)胞死亡〔6〕。細(xì)胞凋亡與壞死不同，是宿主抵抗病原體的重要防御機(jī)制，涉及多種成分和復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。細(xì)胞凋亡的激活機(jī)制包括外源性途徑和內(nèi)源性途徑。外源性途徑通常由細(xì)胞外配體激活，啟動(dòng)細(xì)胞表面死亡受體（如腫瘤壞死因子受體和Fas 受體），形成凋亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物；內(nèi)源性途徑被細(xì)胞內(nèi)信號(hào)激活，依賴于膜間線粒體空間的蛋白質(zhì)釋放〔7〕。細(xì)胞內(nèi)Mtb已經(jīng)進(jìn)化出多種有效的機(jī)制來(lái)調(diào)控宿主細(xì)胞凋亡，許多Mtb效應(yīng)因子與凋亡途徑有關(guān)，已報(bào)道的抗凋亡Mtb抗原包括PtpA、NuoG、PknE、SecA2、SodA、SigH、MPT64 和Rv3354 等〔8〕。Mtb已知的促凋亡抗原包括LpqH（19kda 脂蛋白）、PE_PGRS33、ESAT-6、OppD、PstS1、Rv0183、Rv0901、PE9∕PE10 和Mce4A〔9〕。Mtb感 染 機(jī) 體 后，通 過(guò)ManLAM 激 活A(yù)Kt∕蛋 白 激 酶B∕BCL-2 通路抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞壞死，利于Mtb的擴(kuò)散〔10〕。細(xì)胞凋亡的阻斷和壞死的誘導(dǎo)可能是Mtb逃避或延遲抗原遞呈的主要策略之一。凋亡細(xì)胞的吞噬作用，其中一個(gè)重要的因素是通過(guò)DC 交叉遞呈抗原，凋亡細(xì)胞將抗原呈遞給DC 以增強(qiáng)獲得性免疫，細(xì)胞凋亡控制了細(xì)菌的繁殖，降低了細(xì)菌在細(xì)胞中的生存能力〔11〕。研究發(fā)現(xiàn)，Mtb感染巨噬細(xì)胞后，通過(guò)DC 導(dǎo)致CD8+T淋巴細(xì)胞活化促使吞噬凋亡囊泡釋放〔12〕。Ramos-Martinez 等〔13〕研究表明，DC 的凋亡與Mtb的毒力有關(guān)，Mtb菌株的毒力強(qiáng)弱可導(dǎo)致人類DC 的不同免疫反應(yīng)，毒性較低的Mtb菌株可以誘導(dǎo)DC和巨噬細(xì)胞凋亡，并以此方式成為其他抗原提呈細(xì)胞獲取和促進(jìn)有效適應(yīng)性免疫應(yīng)答的方式。Lee 等〔14〕研究表明Mtb感染機(jī)體后主要導(dǎo)致細(xì)胞壞死，包括H37Ra 和BCG 減毒株在內(nèi)主要誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而控制結(jié)核感染及擴(kuò)散；然而Mtb強(qiáng)毒株如H37Rv 可抑制細(xì)胞凋亡并誘導(dǎo)細(xì)胞壞死，引起結(jié)核擴(kuò)散。Behar等〔15〕研究表明，毒力較弱的Mtb感染機(jī)體后，TLRs 激活絲裂原活化蛋白激酶，誘導(dǎo)腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等促炎因子的產(chǎn)生，P19 可能是弱毒株Mtb的凋亡誘導(dǎo)因子，可以通過(guò)TLR-2發(fā)出信號(hào)并激活caspase-8，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，然而這一機(jī)制依賴時(shí)間和劑量。Danelishvili 等〔16〕研究表明，強(qiáng)毒株Mtb分泌的一些蛋白質(zhì)，如NADH-1、Rv3654c 和Rv3655c 抑制巨噬細(xì)胞凋亡，它們通過(guò)調(diào)節(jié)一氧化氮和促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生來(lái)改變與TLRs 的關(guān)系。強(qiáng)毒株H37Rv 抑制凋亡還可能是由于誘導(dǎo)ESX-1 分泌EspJ 相關(guān)蛋白磷酸化，因此推測(cè)EspJ是Mtb的毒力因子〔17〕，H37Rv還可增加microRNA-132 的表達(dá)，從而阻止人單核細(xì)胞來(lái)源的DC中促炎細(xì)胞因子的分泌〔18〕。

已有研究顯示，細(xì)胞凋亡在機(jī)體免疫系統(tǒng)抵抗Mtb的免疫應(yīng)答及免疫耐受中發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同毒力的Mtb菌株作用于小鼠DC2.4可誘導(dǎo)產(chǎn)生不同的凋亡結(jié)果，毒力較強(qiáng)的Mtb可抑制DC凋亡，以逃避先天免疫和延遲適應(yīng)性免疫的啟動(dòng)；相比之下，毒力較弱的Mtb更易誘導(dǎo)DC 凋亡，減少細(xì)菌活力。細(xì)胞凋亡是Mtb采取的一種重要的免疫逃避策略，在凋亡過(guò)程中，Mtb與宿主細(xì)胞之間的相互作用可以被用來(lái)研究更好的預(yù)防結(jié)核病的措施。盡管目前對(duì)凋亡信號(hào)通路如何被廣泛用作Mtb效應(yīng)器增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)生存和發(fā)病機(jī)制的靶點(diǎn)有所認(rèn)識(shí)，但如不同的Mtb效應(yīng)蛋白在體內(nèi)宿主防御Mtb感染過(guò)程中如何協(xié)調(diào)和調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡等重要問(wèn)題仍有待解決。