灰色關聯分析丹梔逍遙散調節T2DM 胰島抵抗主效應*

★ 許星明 譚榮榮 王曉敏*（江西中醫藥大學中醫學院 南昌 330004）

灰色關聯分析模型是近年一種成熟系統建模方法，具有需要的樣本少，無典型的分布規律，計算量小等特點。其通過求因素的發展態勢和系統之間的關聯度來說明各個因素的變化對系統整體行為的影響程度［1］。該方法已在農業、水利、材料科學、宏觀經濟等多方面得到廣泛應用［2-3］，但在生物系統尤其涉及調節機理的應用研究卻非常少見。

丹梔逍遙散是中醫學調節情志的名方［4］，由當歸、白芍、茯苓、白術、柴胡、丹皮、梔子、甘草等中藥組成，為針對臨床肝郁血虛，內有郁熱證的糖尿病合并抑郁的病機特點所立之方，其主要功效為疏肝解郁、清熱［5］。

本課題組前期研究結果表明丹梔逍遙散能降低血糖、血脂、降低胰島素抵抗，能提高外周胰島素靶組織―肝組織胰島素信號通路的IRS-2mRNA和PI3-KmRNA 表達，但對肝組織的AktmRNA 表達影響不大［6-7］。可能是外周胰島素抵靶點的多樣性引起，但其互相關系未見報道。因此本研究運用灰色關聯模型探討丹梔逍遙散對胰島外周抵抗靶部位肌肉和脂肪Akt、Bcl-2、Casepase-9、Bax、ERK、Glp mRNA 六種基因對糖尿病大鼠血糖影響。

1 材料

1.1 動物 清潔級雄性SD 大鼠60 只，體重200～250 g，購自湖南斯萊克斯實驗動物有限公司。動物飼養于江西中醫藥大學基礎醫學院實驗動物中心。室溫保持在20 ℃～25 ℃，濕度45 %～65 %，12 h 光照，12 h 黑暗。

1.2 藥物及配制 柴胡6 g、當歸6 g、白芍6 g、茯苓6 g、白術6 g、丹皮3 g、梔子3 g、甘草3 g。購于江西省南昌市老百姓藥店，按人與動物體表面積折算法折算大鼠等效劑量為5 g/（kg·d），用5 倍于藥材的冷水浸泡20 min，用武火煎至水沸，改用文火30 min，濾出藥液加冷水適量，煎至水沸，改用文煎煮20 min，濾渣，將兩次煎取藥液混勻濃縮成每毫升含生藥2 g 的藥液，冰箱0 ℃～ 4 ℃保存，每周新鮮配制。

1.3 試劑與儀器 膽固醇、膽酸鈉（生工生物工程（上海）有限公司）；水合氯醛（天津市福晨化學試劑廠）；鹽酸二甲雙胍（正大天晴藥業集團股份有限公司）；羅氏活力血糖儀（Roche 公司）、羅氏活力血糖儀試紙（Roche 公司）。臺式低溫高速離心機CR15T（德國IKA）；SHZ-82 氣浴恒溫振蕩器（金壇市順華儀器公司）；微型離心機D1008E（SCILOGEX），超低溫冰箱Eppendorf 410（美國Eppendorf 公司）；Aquelix 5 二級純水儀（美國Millipore），DU730 型核酸蛋白分析儀GeneAmpPCR System2400；實時熒光定量PCR 儀Applied Biosystems StepOne； Fluor Chem M（凝 膠成像系統）（美國Protein Simple 公司）。

2 方法

2.1 動物模型建立方法和給藥 SD 大鼠，給予高糖高脂乳劑灌胃（66.6 % 基礎料、20 % 豬油、20 %蔗糖、10 %豬油、2.5 %膽固醇、1 %膽酸鈉）1 mL/100（g·d），3 周后，禁食12 h，一次性腹腔注射STZ30 mg/kg 體重（STZ 溶于檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，所配濃度為10 mg/mL），72 h 后內眥靜脈采血測定空腹血糖，篩選血糖＞11.1 mmol/L 大鼠40 只［8］。空白對照組和模型組每日以2 mL 飲用水灌胃；丹梔逍遙散高劑量組10g/（kg·d）、低劑量組5 g/（kg·d）；二甲雙胍組，鹽酸二甲雙胍懸濁液20.8 mg/（kg·d），共8 周。

2.2 血糖 禁食12h 處死大鼠，取其血清測血糖（酶法）。

2.3 組織mRNA 的表達情況 取大鼠的肌肉組織和脂肪組織分別進行RNA 的提取，然后RT-PCR法檢測Akt、Bcl-2、Casepase-9、Bax、ERK、Glp mRNA 的表達情況，并通過AlphaView SA 軟件測量出灰度值。

2.4 灰色分析模型的構建［9］

2.4.1 肌肉和脂肪相關基因的RNA 表達量進行無量綱化處理 取大鼠肌肉和脂肪分別進行RNA 的提取，然后RT-PCR 檢測Akt、Bcl-2、Casepase-9、Bax、ERK、Glp mRNA 的 表 達 情 況，并 通 過AlphaView SA 軟件測量出灰度值，計算各自與內參比值后，采用初值化法進行無量綱化處理。以模型組為對照組，作為初值，根據X'i（k）=Xi 實際（k）/Xi模型（k）（i 為正常、二甲雙胍、高劑量、低劑量組，k 為基因Akt、Bcl-2、Casepase-9、Bax、ERK、Glp）得到無量綱化數組，見表1-2。

表1 各組肌肉中相關基因RNA的無量綱化數值

表2 各組脂肪中相關基因RNA的無量綱化數值

2.4.2 計算絕對差值 逐個計算每個被評價對象指標序列（比較序列）與參考序列對應元素的絕對差值，即|X模型（k）-Xi（k）|（i 為正常、二甲雙胍、高劑量、低劑量組，k 為基因Akt、Bcl-2、Casepase-9、Bax、ERK、Glp），得到絕對差值，見表3-4。

表3 各組肌肉相關目的基因的絕對差值

表4 各組脂肪相關目的基因的絕對差值

2.4.3 找出最大最小絕對差值 肌肉中最大絕對差值為0.56、最小絕對差值為0.03；脂肪中最大絕對差值為0.54 最小絕對差值為0.01。

2.4.4 計算各組關聯系數和關聯度 根據公式分別計算每個比較序列與參考序列對應元素的關聯系數，見表5-6。

（其中X（K）為模型組的無量綱化序列，i為正常、二甲雙胍、高劑量、低劑量組，k 為基因Akt、Bcl-2、Casepase-9、Bax、ERK、Glp，min為最小絕對差值，max 為最大絕對差值，ρ 為分辨系數在［0，1］之間，在這取0.5［10］。）

對各評價對象（比較序列）分別計算其個指標與參考序列對應元素的關聯系數的均值，以反映各評價對象與參考序列的關聯關系，并稱其為關聯度。

根據公式得

表5 各組肌肉中的關聯系數和關聯度

表6 各組脂肪的關聯系數和關聯度

3 結果

3.1 各組的血糖值比較 給藥前，高脂飼料聯合低劑量STZ 造模的各組大鼠血糖明顯升高，與空白對照組比較具有顯著性差異（P＜0.05）。給藥后，與模型組比較，丹梔逍遙散低、高劑量組，陽性對照組對大鼠的血糖下降明顯，有顯著性差異（P＜0.05），見表7。

表7 各組的血糖變化的比較（）組別 n 給藥前（ummol/L） 給藥后（ummol/L）空白對照 8 5.5±0.7 4.8±0.7模型 7 21.0±6.1** 16.6±5.4二甲雙胍 8 20.5±7.6** 10.1±4.7#高劑量 8 19.6±6.2** 12.8±5.1#低劑量 7 20.1±8.4** 12.4±5.2#與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組，#P＜0.05，##P＜0.01。

3.2 肌肉組織相關靶基因對血糖的影響和關聯度 模型組為對照，肌肉組織中各組靶基因表達對血糖的影響：空白對照組0.67，二甲雙胍組0.70，高劑量組0.66，低劑量組0.73。肌肉組織中相關靶基因對血糖的關聯度，其中Bax、Caspase-9、Erk基因對血糖的影響比較明顯。

3.3 脂肪組織各組靶基因表達對血糖的影響和關聯度 空白對照組0.64，二甲雙胍組0.70，高劑量組0.69，低劑量組0.65。相關靶基因對血糖的關聯度，其中Bax、Caspase-9、Erk 基因對血糖的影響比較明顯。

3.4 肌肉組織和脂肪組織的相關靶基因對血糖影響的關聯度 具有一致性。

4 討論

灰色關聯理論是1982 年由鄧聚龍創立的一門學說，將信息不完全作為灰的基本定義即：信息不完全的系統就為灰色系統。信息不完全一般是指的是：系統之間的關系不完全明確、單個系統中各因素關系不完全明確、系統結構不完全知道、系統的作用原理不完全清楚。本研究中，各個基因之間對糖尿病大鼠血糖的影響調控不明確，肌肉和脂肪兩個系統之間對糖尿病大鼠血糖的影響調控不明確，完全符合灰色系統的定義，因此本研究采用了灰色關聯理論分析相關基因對糖尿病大鼠血糖的調控影響，并得出了一致性的結論：外周抵抗靶部位肌肉和脂肪組織中的Bax、Caspase-9、Erk 對糖尿病大鼠血糖的調控影響大，且對血糖影響的關聯度具有一致性。其中Bax、Caspase-9 屬于凋亡基因，而ERK 是細胞外調節蛋白激酶屬于信號通路蛋白。我們推測是否ERK 基因所在的信號通路，對凋亡基因起到調控作用，抑制胰島細胞凋亡，從而促進胰島素的分泌，減低糖尿病大鼠的血糖。不過他們之間是否有聯系，及如何進行聯系的，還需要進一步深入研究。