葛根素通過OPG/RANKL及Wnt/β-catenin信號通路介導(dǎo)對來曲唑引起骨流失的保護(hù)作用

韓俊 蔣現(xiàn)永 葉恒 陳東

武漢科技大學(xué)附屬漢陽醫(yī)院骨科，湖北 武漢 430050

芳香化酶抑制劑治療是激素受體陽性(HR+)乳腺癌絕經(jīng)后婦女的公認(rèn)治療方案[1]。來曲唑是一種非甾體芳香化酶抑制劑，是被批準(zhǔn)用于患有HR+乳腺癌的絕經(jīng)后婦女的三種藥物之一。芳香化酶抑制劑可以阻斷外周組織中雌激素的產(chǎn)生，從而將絕經(jīng)后婦女體內(nèi)循環(huán)中的雌激素水平降低到無法檢測到的水平[2]。雖然雌激素抑制是治療激素反應(yīng)型早期乳腺癌的核心，但雌激素對維持骨密度(bone mineral density，BMD)也是必不可少的。雌激素水平降低，無論是由自然絕經(jīng)還是醫(yī)源性絕經(jīng)引起的，都會導(dǎo)致骨轉(zhuǎn)換增加和骨密度下降[3]。在芳香化酶抑制劑治療期間，進(jìn)一步抑制絕經(jīng)后雌激素水平會加速骨轉(zhuǎn)換、骨丟失和增加骨折發(fā)生率[4]。因此，早期使用抗骨質(zhì)疏松癥藥物治療預(yù)防骨量降低顯得非常重要。葛根素是葛根葉提取物，是一種具有優(yōu)良護(hù)骨作用的植物雌激素，其治療骨質(zhì)疏松癥的療效已被廣泛報道。研究[5]發(fā)現(xiàn)喂飼含葛根素的飼料4周后，可抑制去卵巢小鼠股骨骨密度的下降。此外，葛根素還能預(yù)防去勢雄性大鼠骨丟失[6]。葛根素對破骨細(xì)胞的抑制作用在其治療骨丟失中占有重要地位。鑒于來曲唑常用于治療絕經(jīng)后女性，本研究目的是為了觀察葛根素是否可以防治來曲唑?qū)夏甏菩源笫蠊趋赖挠泻ψ饔谩?/p>

1 材料和方法

1.1 研究方案

30只老年(24月齡)雌性Sprague Dawley大鼠，體重為550～600 g。所有大鼠飼養(yǎng)在標(biāo)準(zhǔn)籠中，每籠4只，12∶12 h光暗循環(huán)，在(23±2)℃的舒適溫度下飼養(yǎng)，并喂食正常的標(biāo)準(zhǔn)嚙齒動物飼料，自由飲用自來水。30只老年雌性大鼠隨機(jī)分為3組(n=10/組)，對照組(CON組)、來曲唑治療組(LQC組)和葛根素聯(lián)合來曲唑治療組(GGS+LQC組)，每組10只。LQC組大鼠每周給予0.1 mg/kg來曲唑(Sigma-Aldrich，Saint Louis，MO，USA)灌胃治療；GGS+LQC組大鼠給予葛根素[50 mg/(kg·d)；Sigma-Aldrich，Saint Louis，MO，USA]灌胃，并每周給予0.1 mg/kg曲唑灌胃治療12周。

1.2 檢測指標(biāo)

采集血樣兩次。首先，在第0周從尾靜脈取血，并在第12周后再次取血。在研究結(jié)束時對所有大鼠實(shí)施安樂死，并通過心臟穿刺收集4 mL血液。將血液以3 500 r/min離心12 min，收集血漿并儲存在-70 ℃直至進(jìn)一步分析。使用ELISA試劑盒測定血清I型膠原羧基端肽β特殊序列(β-CTX)和I型前膠原N端前肽(P1NP)；CV靈敏度分別<8%和<10%。上述試劑盒均使用德國羅氏公司提供。

采用含有Inveon MM系統(tǒng)的Micro-CT掃描股骨干骺端。在體素為8.82 μm、電壓80 kV、電流500μA、曝光時間1 500 ms的360個旋轉(zhuǎn)步長中采集圖像。用Inveon Research Workplace(西門子，慕尼黑，德國)計算參數(shù)如下：骨體積/總體積(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁數(shù)目(Tb.N)、骨小梁間距(Tb.Sp)和骨密度。下頜骨感興趣區(qū)在3個方向均位于生長線以下的股骨干骺端小梁內(nèi)。每組隨機(jī)選取5只大鼠，由3名獨(dú)立評估員進(jìn)行股骨干骺端骨形態(tài)計量學(xué)參數(shù)測量，一式三份。

治療12周后，對大鼠進(jìn)行安樂死，解剖出右股骨。使用乙二胺四乙酸(Sigma-Aldrich，Saint Louis，USA)將股骨樣品脫鈣8周，將脫鈣的骨樣品包埋在石蠟中并使用Maason染色后用顯微鏡(Nikon Eclipse 80i，Tokyo，Japan)檢查組織切片。

隨后對股骨進(jìn)行蛋白印跡(western blot，WB)分析。用RIPA裂解緩沖液提取細(xì)胞總蛋白，用BCA法測定其濃度。用10%SDS-PAGE分離出20 g蛋白，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。膜隨后在室溫下用5%脫脂牛奶封閉2 h，并在4 ℃下與OPG、RANKL、Wnt3α、β-catenin和β-actin抗體(1∶2500；CAT)一起孵育過夜。最后，將膜與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的抗兔IgG抗體(1∶5000；CAT)孵育。編號7074；Cell Signal Technology，Inc.。37 ℃保溫1 h。Image J2X軟件版本2.1.4.7(Rawak Software，Inc.)用來測定蛋白質(zhì)條帶密度。每個實(shí)驗一式三份，重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS版本19.0進(jìn)行統(tǒng)計分析。采用單因素方差分析(One-way ANOVA)和Duncan’s test比較不同組間的數(shù)據(jù)。P<0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨代謝指標(biāo)比較

三組血清P1NP和CTX如表1所示，和CON組比較，LQC組的P1NP和CTX顯著升高(P均<0.05)；而GGS+LQC組P1NP和CTX較LQC組明顯降低(P均<0.05)；各組間血清P1NP和CTX差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(表1)。

表1 各組大鼠在實(shí)驗結(jié)束時測量的骨標(biāo)志物比較

2.2 Micro-CT檢測結(jié)果

Micro-CT更好地顯示了骨小梁的總體改變情況，股骨的微觀參數(shù)如圖1所示。LQC組左側(cè)股骨干骺端骨小梁BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th較CON組明顯降低，而Tb.Sp較CON組明顯升高(P<0.05)；而GGS+LQC組BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th較LQC組明顯升高，而Tb.Sp較LQC組明顯降低(P<0.05)。

圖1 各組大鼠股骨干骺端Micro-CT檢測結(jié)果Fig.1 Results of micro-CT at the femoral metaphysis of three groups of rats注：a：CON組，b：LQC組，c：GGS+LQC組。與CON組相比，*P<0.05；與LQC組相比，#P<0.05。

2.3 老年大鼠組織學(xué)變化的影響

本研究表明，葛根素改善來曲唑?qū)夏甏菩源笫蟮墓墙M織傷害作用。如圖2所示，與LQC組相比，GGS+LQC組的大鼠骨小梁數(shù)量和密度得到明顯的改善。

圖2 各組大鼠股骨干骺端Masson切片檢測結(jié)果 A：CON組，B：LQC組，C：GGS+LQC組(×40)。Fig.2 Results of Masson slices at the femoral metaphysis of three groups of rats. A: CON group, B: LQC group, C: GGS+LQCgroup (×40).

2.4 OPG/RANKL及Wnt/β-catenin信號通路改變

和CON組比較，LQC組的大鼠OPG/RANKL及Wnt/β-catenin信號通路的顯著抑制，OPG、Wnt3α、β-catenin水平顯著降低，RANKL水平明顯升高，差異比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。和LQC組比較，GGS+LQC組OPG/RANKL及Wnt/β-catenin信號通路明顯激活，OPG、Wnt3α、β-catenin水平顯著升高，RANKL水平明顯降低，差異比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

圖3 使用WB檢測OPG、RANKL、Wnt3α、β-catenin和β-actin的相對表達(dá)Fig.3 Relative expression of OPG, RANKL, Wnt3α, and β-catenin to β-actin using Western blotting注：與CON組相比，*P<0.05；與LQC組相比，#P<0.05。

3 討論

雌性SD大鼠在出生后6～8周內(nèi)達(dá)到成熟。研究表明，雌性大鼠在出生后的前3個月達(dá)到最大骨量。但隨著年齡的增長，骨小梁質(zhì)量逐漸減少。骨形成和骨吸收參數(shù)在第3～7個月迅速下降[7]。為了更好地反映老年女性骨代謝狀態(tài)和骨骼特征，選取年齡對骨密度和骨轉(zhuǎn)換指標(biāo)的影響，本實(shí)驗選用24月齡老年雌性大鼠，相當(dāng)于70歲老年女性。本研究使用葛根素治療觀察其對來曲唑加重骨量流失和骨密度降低的影響。首先，老年雌性大鼠進(jìn)行為期12周的治療后，來曲唑能顯著降低骨密度和股骨干骺端端骨小梁微觀結(jié)構(gòu)。其次，葛根素干預(yù)12周后，發(fā)現(xiàn)葛根素能顯著改善來曲唑?qū)夏甏菩源笫蠊晒沁h(yuǎn)端骨小梁BMD和微觀結(jié)構(gòu)影響。第三，在葛根素治療過程中，發(fā)現(xiàn)老年雌性大鼠OPG/RANKL及Wnt/β-catenin信號通路和骨代謝均發(fā)生明顯改變。

本研究發(fā)現(xiàn)LQC組雌性大鼠BMD較CON組明顯降低。另外，在葛根素聯(lián)合來曲唑可以明顯改善來曲唑?qū)敲芏冉档偷挠绊懀瑢?dǎo)致GGS+LQC組BMD明顯升高。除了骨密度，骨保護(hù)的另一個重要評估指標(biāo)是骨骼的形態(tài)參數(shù)，例如骨量和骨小梁厚度等[8]。本研究發(fā)現(xiàn)老年雌性大鼠股骨干骺端的骨小梁骨破裂，骨小梁變薄，骨小梁之間的間距變大。而來曲唑治療后老年大鼠BV/TV、Tb.Th和Tb.N均顯著降低，而Tb.Sp顯著降低；葛根素干預(yù)治療后可以顯著增加骨小梁的數(shù)量以及之間連接，且明顯優(yōu)于LQC組。這表明葛根素可以顯著保護(hù)來曲唑?qū)夏甏菩源笫蠊敲芏群凸橇繐p害作用。

為了進(jìn)一步評價治療效果，在研究結(jié)束時對骨轉(zhuǎn)換指標(biāo)進(jìn)行評估，分別測定血清P1NP和CTX水平作為骨形成和骨吸收的指標(biāo)，CTX在LQC組明顯高于其他組。而葛根素治療后能使骨吸收指標(biāo)(CTX)顯著降低；結(jié)果證實(shí)激素缺乏可導(dǎo)致大鼠的骨量減少和骨吸收增加[9]。研究結(jié)束時，LQC組大鼠血清P1NP平均水平高于其他各組，這可能是由于老年雌性大鼠體內(nèi)雌激素缺乏導(dǎo)致骨轉(zhuǎn)換增加，而LQC干預(yù)后進(jìn)一步影響所致[10-11]，導(dǎo)致血清P1NP升高。而葛根素治療顯著改善LQC對老年雌性大鼠骨代謝的影響，最終導(dǎo)致骨轉(zhuǎn)換下降，出現(xiàn)P1NP和CTX水平明顯降低。

Wnt/β-catenin活性的改變通常與發(fā)展性疾病和疾病(例如癌癥、神經(jīng)元疾病和骨骼疾病)有關(guān)[12]。越來越多的證據(jù)表明，Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)途徑參與了成骨和骨形成的調(diào)控[13]。OPG是TNF受體超家族的成員，在抑制破骨細(xì)胞分化，破骨細(xì)胞吸收功能和促進(jìn)破骨細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用[14]。此外，先前的研究得出結(jié)論，葛根素的抗骨質(zhì)疏松作用是由于通過上調(diào)OPG/RANKL的比例來抑制破骨細(xì)胞的產(chǎn)生[15]。由于OPG/RANKL及Wnt/β-catenin信號通路在骨量流失過程中起著重要的作用，本研究觀察各組老年雌性大鼠治療后OPG、RANKL、Wnt3α、β-catenin表達(dá)情況，結(jié)果表明來曲唑治療組的OPG、Wnt3α和β-catenin表達(dá)明顯降低，這表明來曲唑?qū)墙M織有害作用可能通過抑制OPG/RANKL及Wnt/β-catenin信號通路激活來實(shí)現(xiàn)的；而在來曲唑治療的基礎(chǔ)上給予葛根素干預(yù)后骨密度和骨量得到明顯改善，而OPG、Wnt3α和β-catenin表達(dá)明顯升高，這表明葛根素可以通過激活OPG/RANKL及Wnt/β-catenin信號通路來促進(jìn)骨形成，P1NP和CTX水平降低更好證實(shí)這一點(diǎn)。

總的來說，老年雌性大鼠在使用芳香化酶抑制劑出現(xiàn)明顯的骨量和骨密度降低，使用葛根素治療后可一定程度逆轉(zhuǎn)來曲唑?qū)趋烙泻ψ饔谩５潜狙芯窟x擇研究對象特異性和數(shù)量有限，是否適合其他原因誘導(dǎo)的骨量流失還得進(jìn)一步研究來驗證。