迷迭香提取物對自由基誘導(dǎo)魚肝油氧化及模擬消化過程中脂質(zhì)氧化的抑制作用研究

李云菲，郭曉莉，曹騰正，相啟森，*

（1.鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南鄭州450001；2.河南省食品生產(chǎn)與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，河南鄭州450001）

魚肝油是一種從深海魚的肝臟中提煉出來的脂肪油，富含維生素A、維生素D3及多種不飽和脂肪酸，研究顯示魚肝油中的n-3系列脂肪酸具有提高免疫力、預(yù)防和治療心腦血管疾病的功效[1-3]。其中二十二碳六烯酸（docoxahexaenoic acid，DHA）除有以上功效外，還具有促進(jìn)嬰幼兒智力發(fā)育、提高記憶力、抗衰老以及防治過敏性皮炎等作用[4]。但是大量研究表明富含不飽和脂肪酸的油脂極易在加工、貯藏和食用過程中發(fā)生脂質(zhì)氧化，所產(chǎn)生的氧化產(chǎn)物不僅對色澤、風(fēng)味和質(zhì)地等食品感官品質(zhì)造成不良影響，而且還會降低食品的營養(yǎng)價值[5-6]。因此抑制脂質(zhì)氧化成為脂類食品的重要問題。

迷迭香（Rosmarinus officinalis L.）是目前廣泛應(yīng)用的天然香料植物之一，已被證實(shí)具有抗菌、消炎、抗腫瘤等多種生理活性功能[7-8]。因其具有良好的抗氧化活性，且安全性高，被廣泛用作動植物油脂、油炸面制品、肉及加工肉制品等食品的添加劑[9-11]。因此，本試驗(yàn)分別采用 FeSO4/VC和偶氮二異庚腈[2，2'-azobis（2，4-dimethylvaleronitrile），AMVN]誘導(dǎo)魚肝油氧化，研究迷迭香提取物對魚肝油氧化的抑制作用，同時測定迷迭香提取物對模擬胃腸道消化過程中脂質(zhì)氧化的抑制作用，以期為控制脂質(zhì)氧化提供新思路和新發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

魚肝油：挪威Nycomed有限公司；迷迭香：亳州市雅麗百花茶有限公司；胃蛋白酶（50 000 U/mL）、胰酶（800 U/mL）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）：美國Sigma公司；偶氮二異庚腈（AMVN）：阿拉丁試劑（上海）有限公司；VC、FeSO4·7H2O：天津市大茂化學(xué)試劑廠；丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒：南京建成生物工程研究所；膽汁鹽：上海源葉生物科技有限公司。

Agilent7890B型氣相色譜儀、HP-88色譜柱（100 m×0.25 mm×0.2 μm）：美國 Agilent Technologies有限公司；Multiskan GO型全波長酶標(biāo)儀：美國Thermo Fisher Scientific公司；VCX750型超聲儀：美國Sonics公司；C012型多功能料理機(jī)：九陽股份有限公司；HH-S6型電熱恒溫水浴鍋：北京科偉永興儀器有限公司；XD-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海賢德實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；BSA224S-CW電子天平：德國Sartorius公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 迷迭香提取物的制備

參考Andrade等[12]的方法，并略做修改。將迷迭香干葉用多功能料理機(jī)進(jìn)行粉碎。稱取100 g干粉，加入400 mL 80%乙醇溶液，混勻后室溫（25℃）浸提2 h，過濾得上清液，連續(xù)提取2次，合并濾液，即得迷迭香粗提液。然后將粗提液于40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，所得濃縮液真空冷凍干燥24 h得到迷迭香提取物，研磨，過100目篩后置于-18℃冰箱備用。

1.2.2 魚肝油脂肪酸含量測定

將魚肝油進(jìn)行甲酯化反應(yīng)，采用氣相色譜測定其脂肪酸含量[13]。氣相色譜條件為色譜柱：HP-88（100 m×0.25 mm×0.2 μm）；進(jìn)樣口溫度：270℃；檢測器溫度：280℃；載氣：氮?dú)猓?9.999%）；進(jìn)樣方式：分流進(jìn)樣[分流比 =（柱流量+分流出口流量）/柱流量，100∶1（體積比）]；升溫程序：初溫 100℃，保持 13 min，以10℃/min升至180℃，保持6 min，以1℃/min升至200℃，保持20 min，以4℃/min升至230℃，保持10.5 min；進(jìn)樣量：1.0 μL。

1.2.3 迷迭香提取物對FeSO4/VC誘導(dǎo)魚肝油氧化的影響

配制終濃度為2 mg/mL的魚肝油（乙醇溶解），加入 100 μL 不同濃度（終濃度分別為 10、20、50、100、200、500 μg/mL）的迷迭香提取物溶液，混勻后再分別加入終濃度為5 mmol/L的FeSO4和500 μmol/L的VC，反應(yīng)總體積為1 mL，封口后于37℃水浴避光反應(yīng)4 h。反應(yīng)結(jié)束后，采用MDA試劑盒測定樣品中MDA含量表示魚肝油脂質(zhì)氧化水平，結(jié)果表示為nmol/mL。

1.2.4 迷迭香提取物對AMVN誘導(dǎo)魚肝油氧化的影響

配制終濃度為2 mg/mL的魚肝油，加入100 μL不同濃度（終濃度分別為 10、20、50、100、200、500 μg/mL）的迷迭香提取物溶液，混勻后再加入終濃度為1 mmol/L的AMVN（甲醇溶解），反應(yīng)總體積為1 mL，封口后于37℃水浴避光反應(yīng)12 h。反應(yīng)結(jié)束后，以MDA含量評價魚肝油脂質(zhì)氧化水平。

1.2.5 魚肝油乳液制備

將魚肝油與Tween 20按10∶1（體積比）比例進(jìn)行混勻，采用超聲波在冰浴條件下對其進(jìn)行均質(zhì)，具體條件為：功率225 W，均質(zhì)時間5 min，其中每工作4 s停頓2 s。

1.2.6 模擬胃腸道消化

參考Minekus等[14]的方法制備消化液并對魚肝油乳液進(jìn)行消化處理。

1）模擬胃液：各物質(zhì)終濃度分別為6.9 mmol/L KCl、0.9 mmol/L KH2PO4、25 mmol/L NaHCO3、47.2 mmol/L NaCl、0.1 mmol/L MgCl2·6H2O、0.5 mmol/L（NH4）2CO3，1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH 3.0。

2）模擬腸液：各物質(zhì)終濃度分別為6.8 mmol/L KCl、0.8 mmol/L KH2PO4、84 mmol/L NaHCO3、38.4 mmol/L NaCl、0.33 mmol/L MgCl2·6H2O，1 mol/L NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH 7.0。

3）模擬胃消化樣品制備：分別取150 mL模擬胃液、10 μL CaCl2溶液（0.3 mol/L）、22 mL 魚肝油乳液、3.2 mL胃蛋白酶原液（50 000 U/mL）和 200 μL不同濃度（0、0.125、0.250、0.500、1.000 mg/mL）以去離子水為溶劑的迷迭香提取物溶液并混勻，用1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH 3.0，并用去離子水調(diào)整體積至200 mL。

4）模擬胃消化：將模擬胃消化樣品于37℃、100r/min的水浴條件下進(jìn)行消化反應(yīng)，分別于0、3 h取樣進(jìn)行測定。

5）模擬腸消化樣品制備：分別取55 mL模擬腸液、80 μL CaCl2溶液（0.3 mol/L）、100 mL 模擬胃消化樣品、20 mL胰酶溶液（800 U/mL）、5 mL膽汁（160 mmol/L）和200 μL不同濃度的迷迭香提取物溶液并混勻，用1 mol/L NaOH調(diào)pH值至7.0，最后用去離子水補(bǔ)充至200 mL。

6）模擬腸消化：將上述模擬腸消化樣品于37℃、100 r/min的恒溫水浴鍋中消化，分別于0、2 h取樣進(jìn)行測定。

1.2.7 丙二醛（MDA）含量測定

分別取100 μL模擬胃消化樣品或腸消化樣品，按照MDA試劑盒操作說明書進(jìn)行測定。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)均做3次平行，試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用IBM SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用單因素方差分析（one-way analysis of variance，ANOVA）中的最小顯著差異法（least significant difference，LSD）進(jìn)行顯著性分析，p＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 魚肝油脂肪酸成分分析

采用氣相色譜測定魚肝油脂肪酸組成，結(jié)果見表1。

表1 魚肝油脂肪酸組成Table 1 Fatty acid composition of cod liver oil

由表1可知，魚肝油主要由油酸、花生一烯酸、棕櫚酸、二十二碳六烯酸（DHA）、棕櫚一烯酸、二十碳三烯酸、二十二碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）和肉豆蔻酸等組成，含量分別為16.17%、14.76%、11.47%、16.67%、7.98%、9.25%、9.92%和 4.32%，其次還含有亞油酸、硬脂酸和α-亞麻酸，含量分別為2.54%、2.38%和1.02%。魚肝油不飽和脂肪酸含量為80.67%，其中多不飽和脂肪酸為41.27%，單不飽和脂肪酸為39.40%；另外還含有19.33%的飽和脂肪酸。

2.2 迷迭香提取物對FeSO4/VC誘導(dǎo)魚肝油氧化的影響

丙二醛是油脂中不飽和脂肪酸氧化分解所產(chǎn)生的次級氧化產(chǎn)物，是衡量脂質(zhì)氧化的重要指標(biāo)[15]。迷迭香提取物對FeSO4/VC誘導(dǎo)魚肝油氧化的影響如圖1所示。

圖1 迷迭香提取物對FeSO4/VC誘導(dǎo)魚肝油氧化的影響Fig.1 Effect of rosemary extract on cod liver oil oxidation induced by FeSO4/VC

由圖1可知，對照組魚肝油氧化所產(chǎn)生的MDA含量很低，而經(jīng)FeSO4/VC處理后，魚肝油發(fā)生脂質(zhì)氧化，MDA 含量顯著升高至 385.39 nmol/mL（p＜0.05）；添加終濃度為10 μg/mL至500 μg/mL的迷迭香提取物能夠有效抑制FeSO4/VC誘導(dǎo)的魚肝油氧化。當(dāng)迷迭香提取物終濃度為500 μg/mL時，魚肝油氧化所產(chǎn)生的MDA含量顯著降低了93.47%（p＜0.05）。以上結(jié)果表明迷迭香提取物能夠有效抑制魚肝油氧化，且抑制作用隨其濃度的升高而增強(qiáng)。這與韓靜靜等[16]研究生育酚及其衍生物對FeSO4/VC誘導(dǎo)亞油酸氧化影響的結(jié)果相一致。

2.3 迷迭香提取物對AMVN誘導(dǎo)魚肝油氧化的影響

AMVN[17]是一種脂溶性偶氮類化合物，熱分解條件下會產(chǎn)生烷氧自由基，從而引發(fā)魚肝油脂肪氧化的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，加速油脂氧化。迷迭香提取物對AMVN誘導(dǎo)魚肝油氧化的影響見圖2。

圖2 迷迭香提取物對AMVN誘導(dǎo)魚肝油氧化的影響Fig.2 Effect of rosemary extract on cod liver oil oxidation induced by AMVN

由圖2可知，魚肝油經(jīng)AMVN誘導(dǎo)后，發(fā)生較高程度的氧化反應(yīng)，MDA生成量為38.63 nmol/mL。添加終濃度為10 μg/mL至500 μg/mL的迷迭香提取物能夠有效抑制AMVN誘導(dǎo)的魚肝油氧化。當(dāng)迷迭香提取物添加量為500 μg/mL時，其MDA生成量較未添加迷迭香提取物時顯著降低了60.16%，其抑制效果隨著迷迭香提取物濃度的升高而顯著增強(qiáng)（p＜0.05），這與迷迭香提取物對FeSO4/VC誘導(dǎo)魚肝油氧化的影響相一致。

2.4 迷迭香提取物對模擬胃腸道消化過程中魚肝油氧化的抑制作用

迷迭香提取物對模擬胃消化過程中魚肝油氧化的影響見圖3。

圖3 迷迭香提取物對模擬胃消化過程中魚肝油氧化的影響Fig.3 Effects of rosemary extract on lipid oxidation of cod liver oil during in vitro gastric digestion

如圖3所示，經(jīng)模擬胃消化3 h后，對照組魚肝油中MDA含量相較于0 h時顯著升高了59.39%（p＜0.05），說明魚肝油在模擬胃消化過程中發(fā)生了脂質(zhì)氧化反應(yīng)。添加終濃度為0.125 mg/mL～1.0 mg/mL的迷迭香提取物能夠有效抑制魚肝油在模擬胃消化過程中發(fā)生的氧化。在經(jīng)模擬胃消化3 h后，當(dāng)迷迭香提取物添加濃度為1.000 mg/mL時，MDA含量比對照組降低了41.28%（p＜0.05）。添加迷迭香提取物對模擬胃消化魚肝油氧化的抑制作用隨其添加濃度的升高而增強(qiáng)，呈良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系。

迷迭香提取物對模擬腸消化過程中魚肝油氧化的影響見圖4。

圖4 迷迭香提取物對模擬腸消化過程中魚肝油氧化的影響Fig.4 Effects of rosemary extract on oxidation of cod liver oil during in vitro intestinal digestion

如圖4所示，迷迭香提取物同樣能夠有效抑制魚肝油在模擬腸消化過程中MDA的生成（p＜0.05）。經(jīng)過2 h的消化，當(dāng)迷迭香提取物添加濃度為1.000 mg/mL時，其MDA含量與對照組相比下降了46.62%（p＜0.05）。以上結(jié)果表明，迷迭香提取物能夠顯著抑制魚肝油在模擬消化過程中發(fā)生的氧化反應(yīng)，且其抑制效果隨其添加濃度的升高而增強(qiáng)（p＜0.05），這與Mielnik等[18]得出的結(jié)論相類似。Keokamnerd等[19]也發(fā)現(xiàn)迷迭香提取物能有效抑制因雞肉脂質(zhì)氧化造成的硫代巴比妥酸值 （thiobarbituric acid reactive substance，TBARS）含量的升高。這可能與迷迭香提取物中所富含的多酚類物質(zhì)有關(guān)[20]。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，迷迭香提取物能夠顯著抑制自由基誘導(dǎo)的魚肝油氧化以及魚肝油在模擬胃腸道消化過程中發(fā)生的脂質(zhì)氧化反應(yīng)，其主要原因可能是迷迭香提取物具有較強(qiáng)的自由基清除能力。在今后的研究中應(yīng)采用動物模型進(jìn)一步評價迷迭香提取物對脂質(zhì)氧化的影響及其主要活性組分的穩(wěn)定性，從而為通過改善膳食結(jié)構(gòu)來抑制脂質(zhì)氧化提供科學(xué)理論依據(jù)。