傅里葉變換紅外光譜結合化學計量法對香附水分、灰分和浸出物的快速測定

喬璐，符佳豪，侯益民，李雪菊，趙博宇，董誠明，*，張園園，呂芳

（1.河南中醫藥大學藥學院，河南鄭州450046；2.江蘇省中國科學院植物研究所，江蘇南京210014）

香附為莎草科植物莎草（Cyperus rotundus L.）的干燥根莖[1]。常用于治療肝郁氣滯、月經不調、脾胃氣滯等[2]，同時，香附又有婦科之要藥的美名[3]。在臨床應用非常廣泛，常被制成“香砂養胃片”、“四制香附丸”、“調經益靈片”、“七制香附丸”等多種中成藥，香附所治療的疾病范圍非常廣泛，因此，它在中醫臨床理氣類中藥材中也經常被應用[4]。在臨床應用中，香附主要行使解熱、鎮痛、鎮靜、解痙、抗菌、保護胃黏膜等作用[5]。正是由于臨床應用的需要，目前市場中的香附飲片主要就是生香附和醋炙香附[6-7]。

近紅外光譜是指在紅外光譜范圍中短波長的一類電磁波[8]，依據分子振動吸收的數據不同從而實現物質檢測分析的目的[9-10]。在近紅外檢測范圍內，藥材中的物質成分都能得到大量有效的信息反饋，從整體上反映中藥的化學成分的狀況，對差異細微的紅外光譜進行鑒別，同時傅里葉近紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）分以方便快捷，對樣品無破壞性，對環境無污染，樣品損耗少等優點[11-12]。近年來紅外光譜分析技術在中藥材的應用較為廣泛[13-14]。但對于基礎指標水分、灰分、浸出物的定量分析較少，本文以傅里葉變換紅外光譜結合化學計量法對香附水分、灰分和浸出物進行快速測定，為藥材香附質量標準的制定提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗材料

分別采購了15批共60個香附樣品，經河南中醫藥大學藥學院董誠明教授鑒定為莎草科植物莎草Cyperus rotundus L.的干燥根莖，詳細信息見表1。

1.1.2 試劑

乙醇（分析純）：天津致遠化學試劑有限公司；甲苯（分析純）：山東煙臺雙雙化工有限公司。

表1 香附產地Table 1 Cyperus rotundus place of origin

1.2 儀器與設備

ANTARIS II型傅立葉變換近紅外光譜儀：Thermo SCIENTIFIC美國電熱公司；BX-2.5-10型數顯箱式電爐：上海柏欣儀器設備廠；FA2004N型電子天平：上海民橋精密科學儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 香附的處理

60個香附樣品均經過打粉處理，過5號藥典篩。

1.3.2 香附的水分、灰分和浸出物測定

依據2015版中國藥典規定的甲苯法測定香附樣品的水分含量（通則0832第四法），不超過13%。總灰分測定法測定香附樣品的灰分含量（通則2302），不超過4%。醇溶性浸出物測定法（通則2201）項下的熱浸法測定，含量不低于15%，用稀乙醇作溶劑。

1.4 光譜的采集

本試驗運用ANTARIS II FT-NIR Analyzer對60個香附樣品進行光譜采集，結果見圖1。

圖1 香附樣品的近紅外光譜Fig.1 NIR spectra of Cyperus rotundus

將香附樣品粉末均勻放置于5 cm直徑采樣杯中。方式為旋轉采樣，光譜范圍為12 000 cm-1～4 000 cm-1。背景光譜掃描32次，每個樣品掃描64次，掃描時間平均為60 s。試驗所得樣品光譜為直接去除背景的光譜。

1.5 模型的建立

1.5.1 光譜的預處理

對香附的原始光譜進行預處理，包括光譜的算法、導數、降噪、基線校正等，適宜的預處理方式會對于最終模型的精確度產生重要影響。本試驗中采用二階導數光譜（second derivative），并且選擇導數濾波（norris derivative filter，ND）、卷積法（savitzky-golay，SG）和無平滑（no smoothing，NS）方法進行平滑處理。選擇的光譜范圍是 12 000 cm-1～4 000 cm-1。

圖1中60份香附樣品的近紅外光譜整體趨勢相同，全部樣品光譜在10 000 cm-1～12 000 cm-1光譜范圍中波動較大，應該是噪聲所致。60個樣品光譜在10 500 cm-1～8 800 cm-1范圍內趨勢平緩；在 8300、6800、5 600、5 200、4 700、4 400、4 300 cm-1處可見明顯波峰，在 5 400、5 000、4500、4200 cm-1處可見明顯波谷。

1.5.2 模型的驗證與校正

本試驗借助于TQ Analyst軟件來進行香附快速測定模型的建立，采用定量校正算法，主要使用偏最小二乘法（partial least squares，PLS）與逐步多元線性回歸法（sparse multinomial logistic regression，SMLR）。光程選擇時采用多元信號修正（multiplicative signal correction，MSC）與內參考標準法（internal reference，IR），以此來減小誤差，設置目標組分含量的上下限時，將下限值設置為香附樣品目標組分含量最低值的95%，上限值設置為香附樣品目標組分含量最高值的105%。光譜范圍的選擇則依據TQ Analyst軟件中的suggest向導進行。

在進行光譜預處理時，本試驗分別采用IR、MSC方法并以內部交叉驗證模型相關系數（R2）為指標，其中模型的相關系數（R2）越接近1，說明試驗所得樣品的化學值與近紅外模型的預測值越接近，即相關性越好，而均方根誤差校正集預測均方差（root mean square error of calibration，RMSEC）與預測集預測均方差（root mean square error of prediction，RMSEP）的值越小，則說明所建模型的預測性能越好[15-16]。

2 結果與分析

2.1 香附的水分、灰分、浸出物含量

對香附的水分、灰分、浸出物含量測定結果見表2。

表2 香附的各成分含量Table 2 Content of constituents of Cyperus rotundus

由表2可知，香附水分含量6.27%～13.7%，灰分含量1.69%～4.04%，浸出物含量15.04%～25.77%，所得數據均符合2015版藥典規定。

2.2 香附水分、灰分、浸出物定量模型的建立

對光譜模型進行擬合，篩選出最佳模型見表3。

表3 光譜處理方法分析結果Table 3 Analysis results of spectral treatment method

續表3 光譜處理方法分析結果Continue table 3 Analysis results of spectral treatment method

對光譜模型進行擬合，篩選出最佳模型。其中，香附的水分模型以SMLR+MSC+2nd Der+ND模型最好，香附的灰分模型以PLS+MSC+2nd Der+NS模型最好，香附的浸出物模型以SMLR+IR+2nd Der+ND模型最好。

2.3 香附水分灰分浸出物模型

分別建立的香附水分、灰分和浸出物的預測模型，結果見表4。

隨機選取建模樣本為52個，驗證樣本8個，光譜范圍為12 000 cm-1～4 000 cm-1。香附水分的預測模型精度R2=0.902 7，RMSEC=0.774，預測均方差RMSEP=0.521；香附灰分所得模型精度R2=0.988 4，RMSEC=0.061 9，RMSEP=0.058 5；香附浸出物模型中，精度R2=0.890 3，RMSEC=1.25，RMSEP=2.33。所建模型精度高，均方根誤差小。

2.4 香附水分、灰分、浸出物模型對未知含量樣品的預測

對香附水分、灰分、浸出物模型進行驗證，結果見表5。

表4 香附模型Table 4 Cyperus rotundus model

表5 香附水分、灰分、浸出物含量的預測Table 5 Prediction of moisture，ash and extractum content of Cyperus rotundus

從表5中的數據可以看出，在隨機挑選出的8個香附樣品中，所建立的香附灰分快速測定模型在絕對偏差上是明顯要低于香附水分和浸出物快速測定模型，而本身在所得3種模型的精度上就是香附灰分快速測定模型的精度最高，相關系數R2高達0.988 4，也就進一步證明了試驗所得模型可以應用于香附水分、灰分、浸出物含量的快速測定，且測定精確度與相關系數R2呈正相關。將未參與建模的8個樣本帶入模型，回執預測值和實測值的散點圖見圖2～圖4。檢驗樣本集中在趨勢線y=x附近，表明模型精度高，穩定性強。

圖2 香附水分預測值與實測值Fig.2 Predicted and measured values of Cyperus rotundus moisture content

圖3 香附灰分預測值與實測值Fig.3 Predicted and measured values of Cyperus rotundus ash content

圖4 香附浸出物預測值與實測值Fig.4 Predicted and measured values of Cyperus rotundus extractum content

3 結論與討論

本研究利用傅里葉近紅外光譜（NIRS）分析技術建立了香附水分、灰分、浸出物的快速預測模型，并應用未參與數據驗證，實現了香附樣品中相關指標的快速精準的測定，其中香附水分模型中，光譜預處理選擇多元信號修正（MSC）+二階導數光譜+ND，逐步多元線性回歸法建模，光譜范圍12 000 cm-1～4 000 cm-1。模型 R2為 0.902 7，RMSEC 為 0.774，RMSEP 為 0.521。香附灰分以偏最小二乘法建模，光譜處理包括MSC+2nd Der+NS，模型 R2為 0.988 4，RMSEC 為 0.061 9，RMSEP為0.058 5。香附浸出物模型中，光譜處理包括內參考標準法IR+2nd Der+NS，選擇偏最小二乘法建模，模型 R2為 0.890 3，RMSEC為 1.25，RMSEP為2.33。其中香附灰分模型精確度較高，水分和浸出物的模型精確度略低，可能是在香附樣品水分、浸出物含量測定時的誤差所致。以上所得模型對于香附水分、灰分、浸出物含量的預測均有較高的精確度，可實現近紅外光譜分析技術對香附水分、灰分、浸出物含量的快速測定，這為香附質量標準的制定提供理論依據。