介紹一種外泌體負染色的改良方法

首都醫科大學（100069）金良韻 姬曼 孫竹林 楊慧 陳大興 趙君朋

細胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)為磷脂雙分子層的小囊泡，其直徑范圍在30nm～150nm之間，其在細胞膜上生成，后分泌到細胞外，其囊泡內包含有蛋白質、脂類等多種成分，作用主要是能夠與附近及遠距離細胞進行通訊聯系[1]。細胞外囊泡是細胞間重要的信息傳遞器，因此可以被用作藥物傳遞系統或疾病生物標志物[2]。外泌體介導的細胞間通訊主要通過以下三種方式：一是外泌體膜蛋白可以與靶細胞膜蛋白結合，進而激活靶細胞內的信號通路。二是在細胞外基質中，外泌體膜蛋白可以被蛋白酶剪切，從而激活細胞內的信號通路。三是外泌體膜可以與靶細胞膜直接融合，非選擇性的釋放其所含的蛋白質、mRNA以及microRNA。外泌體的提取可以分為以下幾種：超速離心法、過濾離心、密度梯度離心法、免疫磁珠法、ps親合法等提取方式。目前來說超速離心法是被應用最廣泛的方法。本文用超速離心法對外泌體進行提取，所用的改良版外泌體負染色中加入冷凍超薄切片試劑中的甲基纖維素（MC），由于其能對外泌體膜起到支撐作用，所以期待能得到更佳的外泌體形態電鏡圖像。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 收集正常小鼠血清樣品，采用超速離心法提取外泌體。2%多聚甲醛（PFA）購置于英國阿法埃莎公司（Alfa Aesar），用0.1M PBS液配置，并于4℃冰箱保存。1%戊二醛（GA）購置于英國阿法埃莎公司（Alfa Aesar），用0.1M PBS液配置。醋酸雙氧鈾（SPI），用超純水配成4%溶液，密閉、避光保存。2%甲基纖維素（MC）購于美國Sigma公司。200目方華膜加碳膜的銅網購自北京中鏡科儀技術有限公司。日立-天美HT7700透射電子顯微鏡。

1.2 方法

1.2.1 醋酸雙氧鈾負染色方法 采用銅網懸浮法，進行外泌體的附著和染色方法。操作如下：①將新鮮提取外泌體固定在50～100μl的2%PFA中。②取沉淀5μl，在銅網上孵育20min。③將銅網倒扣在50μl醋酸雙氧鈾液滴上，孵育5min。④轉移到100μl的雙蒸水液滴中漂洗2min。⑤濾紙吸干、迅速烤干后，于透射電子顯微鏡下觀察。

附圖1 普通醋酸雙氧鈾染色的結果。a：低倍可見外泌體形態不規則，膜結構（）有塌陷。標尺=500nm；b：高倍可見外泌體立體結構不明顯，形態不規則，且外泌體膜（）有塌陷。標尺=200nm

附圖2 改良版負染色的結果。a：低倍可見外泌體形態基本規則，立體結構明顯，膜結構（）光滑飽滿。標尺=200；b：高倍可見外泌體大小集中在80nm～120nm之間，主要是膜結構光滑、飽滿，反差明顯，觀察效果佳。標尺=200nm

2 結果

2.1 普通醋酸雙氧鈾染色的結果 見附圖1。

2.2 改良版負染色法的結果 見附圖2。

3 討論

用負染色的方法在透射電鏡下觀察外泌體的形態，是目前最可靠的方法，需要在透射電子顯微鏡下找到其符合外泌體形態特征的囊泡[3]。負染色方法的原理是利用高密度的、在透射電鏡下不顯示結構的重金屬鹽，將生物標本包圍起來，以增強背景散射電子的水平，吸附了重金屬鹽的樣品的超微結構在黑暗的背景上顯示陰性反差[4]。而負染色既簡單便捷、又節省試劑耗材，都是其優點，故而使其廣泛應用在細菌、病毒、大分子結構的研究中，也是透射電子顯微技術中一項重要的實驗技術手段。

目前幾種方法中醋酸雙氧鈾染色效果被認為是最佳，但是仍然有其局限性和不足，故本實驗針對其不足補充了甲基纖維素(MC)和鈾(UA)混合液進行雙染的方法，對其膜結構進行優化染色?？梢姼牧己蟮耐饷隗w形態結構更完整，外泌體膜結構更光滑，立體結構也更明顯。MC第一次在電子顯微鏡技術中常規使用在干燥過程中支持醛固定的冷凍超薄切片技術中。當重金屬被包裹在薄膜中時，MC可以防止膜結構的崩塌，并能夠出現顯著均勻度對比。從早期的冷凍實驗的結果來看，研究表明尤其在小的細胞器，如外泌體、內小體、自噬體的分離膜中起到支持和對比方面的作用[5]。在本實驗中，筆者證實了含有醋酸雙氧鈾的MC膜在脂質結構的對比上提供了顯著的改進，優于單獨應用醋酸雙氧鈾的負染色。這種MC嵌入染色程序提供了吸附粒子的全面可視化，并限制了這些軟生物結構的膜崩潰。MC和UA的雙染方法有可能大大改善常規表征和定量的廣泛的合成以及自然發生的膜結構。

本實驗中需要注意的細節有：①應用甲基纖維素試劑時，應該在冰上操作。②筆者盡量用新鮮提取的外泌體樣本，直接浸在PFA液體中，以及時固定膜結構，固定后可在4℃冰箱保存一周，越早做結構越好。③應避免對提出的外泌體樣本進行反復-20℃或-80℃的凍融，而對囊泡的形態造成影響。④使用醋酸雙氧鈾時，注意避光處理，并且注意輻射危害并妥善處理染液。

雖然用負染色對外泌體進行形態鑒別是現在常用的手段，但也存在不足及有待改進。也可以用特異性抗體對外泌體進行標記，以區分提取過程中混入的微泡?；蛘哂美鋬鲭娮语@微鏡直接觀察外泌體的形態結構，當然這種方法無需化學固定劑，也就避免了化學固定中的結構變化，故可以最大程度的保存生物活性[2]。所以，也期待著后續隨著對外泌體的研究更加的深入，以便能更加明確外泌體的機制，對臨床的應用提供更有價值的研究思路。