HER4在不同病理分級膠質瘤中的表達及意義

張新鵑 孫 龍 王海風 姜旭光

1.山東中醫藥高等?？茖W校西醫教學部，山東煙臺 264199；2.山東省臨沂市中心醫院神經外科，山東臨沂 276400

膠質瘤是人類中樞神經系統原發性惡性腫瘤最常見的一種，目前對膠質瘤的治療主要以手術切除為主。而高級別膠質瘤尤其是膠質母細胞瘤，因其富集血管且彌漫浸潤性生長，所以治療效果很差。隨著分子生物學、腫瘤免疫學、生物技術等進步出現了分子靶向治療，即從分子水平針對關鍵基因、細胞受體和調控分子為靶點治療。分子靶向治療目前已經在臨床應用于膠質瘤患者，并取得不錯的治療效果，這給膠質瘤的治療帶來了新的希望。因此，尋找有效靶點將非常有利于膠質瘤的臨床治療。國內研究發現，HER4（又稱erbB4）與某些惡性腫瘤的發生、發展和轉移有關[1]。本實驗通過免疫組織化學法檢測正常腦組織和病理級別不同的膠質瘤組織中的HER4表達情況，來研究HER4在膠質瘤發生及發展過程中的作用，為膠質瘤的研究提供依據，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取88例膠質瘤標本為臨沂市中心醫院病理科存檔、且在2008年1月～2009年12月接受手術治療的初發患者，由該院病理科資深醫師對所有膠質瘤標本核查和篩選，并依照WHO 中樞神經系統腫瘤的分類標準[2]對標本行病理分級（Ⅰ～Ⅳ級）：Ⅰ級8例，Ⅱ級25例，Ⅲ級33例，Ⅳ級22例。其中，Ⅰ、Ⅱ級為低級別膠質瘤，Ⅲ、Ⅳ級為高級別膠質瘤。另取該院腦外傷患者開顱減壓術切除的正常腦組織標本14例為對照組，本研究經臨沂市中心醫院醫學倫理委員會批準，患者及家屬同意。將全部組織標本制成病理切片，保存備用。

1.2 主要試劑和方法

主要試劑：鼠抗人HER4 單克隆抗體HFR-1：英國Abcam公司（批號GR256899-7）；免疫組化試劑盒：北京中杉金橋生物技術有限公司；DAB 顯色劑：北京中杉金橋生物技術有限公司。

實驗方法：將石蠟切片常規脫蠟水化，以蒸餾水漂洗5 min，切片置于0.01 mol/L 枸櫞酸緩沖液（pH 6.0）中進行高溫抗原修復2 min，并自然冷卻25 min，冷水沖洗缸子可加快冷卻。取出切片，以蒸餾水沖洗2次、每次3 min，之后用PBS 液反復沖洗，共3次、每次3 min。然后用3%濃度的H2O2浸泡10 min 以阻斷滅活內源性過氧化物酶，PBS 液沖洗3次、每次3 min。擦干周圍的PBS 液后用山羊血清封閉，37℃孵育30 min。去除周圍的血清后滴加一抗（稀釋度為1∶200），保存在4℃冰箱，過夜。按照試劑盒使用說明操作（陽性乳腺癌組織作為陽性對照、PBS 液代替一抗作為陰性對照），PBS 液洗3次、每次5 min，擦干周圍的PBS液后滴加DAB 顯色劑，清水沖洗后進行蘇木精復染色。蒸餾水充分沖洗后脫水、干燥、封片。

1.3 免疫組織化學染色結果判斷

以細胞核和（或）細胞質中出現淺黃、棕黃或棕褐色深淺不等的顆粒為HER4陽性表達，觀察每高倍鏡（400×）視野中陽性細胞占所有細胞的百分比：陰性為陽性細胞數<5%，陽性為≥5%。

采用IPP 6.0 圖像分析軟件進行免疫組織化學法半定量分析：高倍鏡（400×）下隨機選取5個視野，測量其積分光密度（IOD）值，即將圖像上陽性點的光密度值加起來，測量選取的區域面積（area）。最后，計算光密度平均值（IOD/area）。

1.4 統計學方法

采用SPSS 16.0 統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t 檢驗，多組間比較采用單因素方差分析；計數資料采用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HER4陽性表達率

膠質瘤組織為61.4%（54/88），正常腦組織為14.3%（2/14），差異有統計學意義（χ2=10.812，P=0.001）。

2.2 HER4在細胞質和細胞核陽性的表達

其表達量隨膠質瘤病理分級的提高而增加，詳見圖1（封三）。正常腦組織中HER4表達的IOD/area值為0.09±0.02，低級別膠質瘤IOD/area值為0.20±0.03，高級別膠質瘤IOD/area值為0.31±0.08；低級別膠質瘤IOD/area值高于正常腦組織（P<0.05），而高級別膠質瘤IOD/area值又高于低級別膠質瘤，差異均有統計學意義（P<0.05）。

圖1 HER4在正常腦組織及不同病理分級膠質瘤中的表達（400×）

3 討論

HER4 基因首先是由Lai 和Lemke 于1991年在新生鼠神經系統的發育中發現的，并發現該基因在新生鼠神經系統的發育過程中普遍表達[3]。1993年，Plowman 等[4]克隆出人體組織中的該基因，并發現它是編碼I型受體酪氨酸激酶（RTK）家族第4個成員HER4 的基因，蛋白分子量為18 OKD。作為跨膜受體蛋白的HER4，其調控細胞的生長、分化、增殖、血管生成和凋亡的機制為：HER4 與配體結合后可通過自身磷酸化參與到細胞的信號傳遞過程中，信號通過激酶級聯傳遞發揮作用。HER4在正常人體除甲狀腺、腎小球及外周神經以外的全身組織中均有不同程度的表達，但均較少[5]。

國內外學者研究HER4 與惡性腫瘤間關系的并不在少數，而結果卻不盡相似。近年大多數研究發現：HER4 的過度表達出現在多種惡性腫瘤組織中，多種惡性腫瘤的發生及發展都有HER4 的參與、調控[6-11]。國內幾項研究還發現，食管鱗癌、結腸癌、肝內膽管癌中不僅有HER4 的高表達，且HER4表達情況與這些腫瘤的臨床分期緊密相關[12-14]；同期國外的另幾項研究也發現，骨肉瘤、原發性顱內腦膜瘤及鼻腔黏膜惡性黑色素瘤也有HER4 的高表達，HER4表達與這些腫瘤病理分級成正相關[15-16]。而早些的研究卻出現過相反情況：普通痣中HER4陽性表達率最高，而HER4的陽性表達率在異常增生痣、黑色素瘤中卻逐級降低[17]。另一研究表明，涎腺黏液表皮樣癌雖有HER4 高表達，但HER4表達與病理組織學分級兩者間的關系卻明顯負相關[18]。目前國內外關于膠質瘤中HER4表達情況的研究少見。本研究結果顯示，HER4在膠質瘤中存在高表達，與正常腦組織相比差異有統計學意義（P<0.05）；且HER4 的表達量隨著膠質瘤病理級別的升高相應增加。這與近年來的大多數研究結果近似。由此可推斷：HER4在膠質瘤的發生、發展中有重要作用，HER4 可作為評價膠質瘤惡性程度的重要生物學指標；HER4 也有望成為膠質瘤分子靶向治療的新靶點。