高碳基土壤修復肥對連作煙田土壤改良及烤煙生長發育的影響

楊立均，郝浩浩，許曉敬，吳俊林，魯雅雯，金維環，郭紅祥*

(1.河南省煙草公司 駐馬店市公司，河南 駐馬店 463000；2.河南農業大學 生命科學學院，河南 鄭州 450002)

近年來，隨著我國耕地面積的逐年減少，為了提高農業總體生產力，大量的化肥被施入土壤，不僅導致土壤酸化、板結以及養分流失，而且還降低了肥料利用率，嚴重影響著農產品的品質[1-2]。因此，深入研究土壤改良機制，探索土壤綜合治理措施，改善土壤理化性狀，提高土壤的生產力，構建煙田健康和諧的土壤環境，是我國煙葉生產可持續發展的最終途徑。生物質炭不僅可以降低土壤容重，提高土壤pH值、團聚性和持水能力，而且還可作為一種天然的氮素肥料緩釋劑延緩肥料在土壤中的釋放，降低養分淋失。高碳基土壤修復肥是一種高碳低氮肥料，主要由生物炭、有機載體、天然礦物質肥、腐殖酸、微量元素等成分組成，大量的研究表明，生物質炭與肥料混合施用，對作物的生長發育和產量均表現出正效應[3-6]。土壤、植物和肥料三者之間，既是互相關聯，又是相互影響、相互制約的?？茖W施肥要充分考慮三者之間的相互關系，針對不同的土壤與作物進行合理施肥。不同的土壤養分對土壤微生物群落的影響非常大，繼而影響土壤養分的利用和對土壤的改良[7-8]。因此，仍需針對特定土壤開展合理施用高碳基土壤修復肥的研究。駐馬店市是河南省烤煙生產的主要地區之一，長期單一的煙草種植模式容易造成土壤質量退化，土壤中微生物區系平衡被破壞，作物病蟲害滋生，影響煙草的正常生長發育，最終造成產量和品質降低。因此，本文選取河南駐馬店煙區為試驗區，通過土壤微生物群落變化、土壤酶、土壤養分和煙草生長發育的全面系統分析，評價了施用高碳基肥改良土壤的效果，形成了適合河南駐馬店煙區的高碳基肥施用方案，可為煙田的可持續發展和合理施肥提供科學依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試煙草品種是中煙100。供試高碳基土壤修復肥來自河南惠農土質保育研發有限公司，其總養分(N+P2O5+K2O)≥5%、有機質(干基)≥45%、生物炭≥20%、粗脂肪≥1%、水分≤20%。供試重茬抗病肥(微生物菌肥)來自河南萬畝康生物科技有限公司，其總養分(N+P2O5+K2O)≥5%、有機質≥45%。煙草專用肥(N 10%、P2O512%、K2O 18%)為市購。

1.2 試驗設計

在駐馬店煙區選擇煙草連作3年以上的中低產煙田(pH 4.98，有機質11.9 g/kg，水解性氮77.4 mg/kg，有效磷11.6 mg/kg，速效鉀175 mg/kg)，采用完全隨機區組設計，共5個處理：CK，常規施肥(煙草專用肥750 kg/hm2，餅肥600 kg/hm2)；T1,常規施肥(減74.96 kg煙草專用肥/hm2)+高碳基土壤修復肥375 kg/hm2；T2,常規施肥(減149.92 kg 煙草專用肥/hm2)+高碳基土壤修復肥750 kg/hm2；T3,常規施肥(減209.89 kg 煙草專用肥/hm2)+高碳基土壤修復肥750 kg/hm2+重茬抗病肥298.5 kg/hm2；T4,常規施肥(減224.88 kg 煙草專用肥/hm2)+高碳基土壤修復肥1125 kg/hm2。每個處理0.013 hm2，每個處理重復3次。在大田旺長期，每個試驗小區各隨機選取6棵健康生長的煙株，測定煙株的農藝性狀和光合指標；將煙株的根系完整挖出，去除根際外圍土壤，輕輕將根部附著的土壤(4 mm內)揉捏抖動到封口袋中，放入冷藏箱運回實驗室，除去雜根等后提取土壤DNA。剩余根際土壤用于理化性質的測定。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 土壤微生物分析 提取土樣總DNA后，進行PCR擴增，形成測序文庫；先對建好的文庫先進行文庫質檢，再對質檢合格的文庫用Illumina HiSeq 2500進行測序。對原始數據進行拼接(FLASH，version 1.2.11)，將拼接得到的序列進行質量過濾(Trimmomatic，version 0.33)，并去除嵌合體(UCHIME，version 8.1)，得到高質量的Tags 序列。使用QIIME(version 1.8.0)軟件中的 UCLUST對Tags在97%的相似度水平下進行聚類，獲得OTU，并基于細菌的Silva 數據庫(Release128，http://www.arb-silva.de)和真菌的Unite 數據庫(Release 7.2， http://unite.ut.ee/index.php)對OTU進行分類學注釋。利用Mothur(version v.1.30，http://www.mothur.org/)軟件進行土壤微生物α 多樣性分析，包括Chao1豐富度指數、Ace 豐富度指數、Shannon指數和Simpson指數。

1.3.2 煙株生長發育測定 在旺長期，采用便攜式光合測定儀測定光合作用等指標，記錄株高、莖圍、葉長、葉寬、地上部與地下部的鮮重和干重。每個處理取6株，計算平均值。

1.3.3 土壤理化性質測定 土壤pH值用pH計進行測定，有機質含量用重鉻酸鉀法測定，可溶性氮、速效磷和速效鉀含量測定由河南省農業科學院科學實驗中心分析完成[9-10]；土壤酶活性分析采用關松蔭的方法[11]。

1.3.4 基因表達檢測 采用qPCR方法分析根系養分吸收相關基因的表達(表1)。用TRIzol法提取根系的總RNA，用TaKaRa公司的One Step PrimeScript RT-PCR Kit (Perfect Real Time) 合成cDNA。用TaKaRa SYBR_Premix Ex TaqTMⅡ(Perfect Real Time)試劑盒進行qPCR檢測。每個反應體系包含2 μL稀釋后的cDNA、正反引物各0.5 μL、12.5 μL 2×SYBR_Premix Ex TaqTMⅡ和9.5 μL水(nuclease-free)。反應程序如下：95 ℃ 30 s后，運行40個循環(95 ℃ 5 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s)，每個樣品重復3次。將NtActin作為內參基因。引物序列見表1，用2-△△CT法計算表達量。

表1 基因表達檢測引物

1.4 數據統計及分析

對收集的數據使用SPSS 20.0進行整理分析，不同處理間差異性分析采用Duncan’s多重比較進行，圖表繪制使用Excel 2013完成。

2 結果與分析

2.1 高碳基土壤修復肥對土壤微生物多樣性的影響

土壤微生物是土壤的重要組成部分，它對土壤肥力的形成和植物營養的轉化起著積極的作用，土壤微生物種類、數量可以作為評價土壤肥力的指標[12-14]。表2顯示了煙草旺長期土壤微生物群落和α多樣性，各處理細菌的OTU數、香農-威納指數、ACE指數和Chao1指數顯著高于對照，表明施用高碳基土壤修復肥能夠增加土壤細菌數量和種類。各處理真菌的OTU數、香農-威納指數、ACE指數和Chao1指數顯著低于對照，表明施用高碳基土壤修復肥能夠減少土壤真菌數量和種類。

表2 土壤微生物群落與α多樣性分析結果

從圖1可以看出，煙草土壤細菌相對豐度較高的菌門有變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、綠彎菌門(Chloroflexi)、厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)、 擬桿菌門(Bacteroidetes)、浮霉菌門(Planctomycetes)和螺旋體門未知屬(Saccharibacteria)，這10個菌群的總量占土壤整個細菌群落的95.5%以上。由于生活習性和生態適應性的差異，不同土壤細菌對高碳基土壤修復肥的響應也不同，施用高碳基土壤修復肥處理的酸桿菌門(Acidobacteria)和芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)相對豐度大于CK，T2處理的酸桿菌門豐度最大，T1處理的芽單胞菌門豐度最大。放線菌門(Actinobacteria)和厚壁菌門(Firmicutes)相對豐度隨著高碳基土壤修復肥施用量增加而減少。

從圖2可以看出，在細菌屬水平上相對豐度較高的有酸桿菌屬(uncultured_bacterium_f_Acidobacteriaceae_[Subgroup_1])、芽單胞菌屬(Gemmatimonas)、待定放線菌門Gaiellales屬(uncultured_bacterium_o_Gaiellales)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、Candidatus_Solibacter、uncultured_bacterium_f_Gemmatimonadaceae、鏈霉菌屬(Streptomyces)、亞硝化單胞菌屬(uncultured_bacterium_f_Nitrosomonadaceae)、酸微菌屬(uncultured_bacterium_o_Acidimicrobiales)。各處理鞘氨醇單胞菌屬和鏈霉菌屬的豐度均大于對照，酸桿菌屬和Candidatus_Solibacter的豐度小于CK，表明高碳基土壤修復肥的施用可以增加鞘氨醇單胞菌屬和鏈霉菌屬的豐度，降低酸桿菌屬和Candidatus_Solibacter的豐度。

A：Unclassified；B：uncultured_bacterium_f_Acidobacteriaceae_[Subgroup_1]；C：Sphingomonas；D：Candidatus_Solibacter；E：Gemmatimonas；F：uncultured_bacterium_o_Gaiellales；G： Streptomyces；H：uncultured_bacterium_f_Nitrosomonadaceae；I： uncultured_bacterium_f_Gemmatimonadaceae；J：uncultured_bacterium_o_Acidimicrobiales；K：Unknown。圖1 高碳基土壤修復肥對土壤細菌門水平相對豐度的影響

圖2 高碳基土壤修復肥對土壤細菌屬水平相對豐度的影響

物種注釋結果表明，所有處理真菌門水平相對豐度真菌菌群歸為12個門類：子囊菌門(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)、球囊菌門(Glomeromycota)、壺菌門(Chytridiomycota)、毛霉亞門(Mucoromycota)、隱真菌門(Rozellomycota)、被孢霉門(Mortierellomycota)、絲足蟲類(Cercozoa)、捕蟲霉門(Zoopagomycota)、梳霉門(Kickxellomycota)、Calcarisporiellomycota、Aphelidiomycota，其中子囊菌門和擔子菌門真菌是優勢菌(圖3)。高碳基土壤修復肥能增加擔子菌門的相對豐度，降低子囊菌門的相對豐度。

圖3 高碳基土壤修復肥對土壤真菌門水平相對豐度的影響

圖4顯示相對豐度比較高的真菌屬有中國斑褶菇屬(Panaeolus)、裸蓋菇屬(Psilocybe)、小棒孢囊殼屬(Corynascella)、被孢霉屬(Mortierella)、鏈格孢屬(Alternaria)、青霉屬(Penicillium)、Guehomyces、Immersiella。與CK相比，所有處理的中國斑褶菇屬和裸蓋菇屬相對豐度降低，而青霉屬和小棒孢囊殼屬的相對豐度增加。

圖4 高碳基土壤修復肥對土壤真菌屬水平相對豐度的影響

圖5為各處理的土壤細菌COG功能預測分析結果，能源生產和轉換、氨基酸轉運和轉換、碳水化合物運輸、轉錄、細胞壁/膜合成、信號轉導機制是最主要的功能，T2和T3處理的豐度明顯高于對照和其他處理。

2.2 高碳基土壤修復肥對土壤酶和養分的影響

土壤酶活性與土壤微生物類群密切相關，土壤酶活性不僅能夠反映土壤微生物群落的代謝狀況，還可以作為評價土壤肥力高低、生態環境質量優劣的一個重要生物指標[15-16]。表3顯示，T1、T2的脲酶、磷酸酶和蔗糖酶活性隨著高碳基土壤修復肥施用量的增加而提高，T3處理的3種酶活性明顯高于T2，說明在高碳基土壤修復肥施用量相同的情況下配施微生物肥能夠進一步改良土壤，提高酶活性。T4的3種酶活性與T1、T2差異不顯著，說明過多施用高碳基土壤修復肥會降低促進酶活的效率。

表3 高碳基土壤修復肥對土壤酶活性的影響

A：RNA加工和修飾；B：染色質結構和動力學；C：能源生產和轉換；D：細胞周期控制、染色體分配；E：氨基酸轉運和轉換；F：核苷酸轉運和代謝；G：碳水化合物運輸；H：輔酶轉運和代謝；I：脂質運輸代謝；J：翻譯,核糖體結構與合成；K：轉錄；L：復制、重組與修復；M：細胞壁/膜合成；N：細胞動力；O：翻譯后修飾與加工；P：無機離子轉運和代謝；Q：次級代謝；R：一般功能預測；S：未知功能；T：信號轉導機制；U：細胞內分泌、運輸與交換；V：防御機制；W：細胞外結構；Y：核結構；Z：細胞骨架。圖5 高碳基土壤修復肥對土壤細菌功能豐度的影響

表4顯示煙田土壤pH值范圍為5.14～5.76，隨著高碳基土壤修復肥施用量的增加，土壤根際土壤pH值逐漸增加，因此高碳基土壤修復肥可以用作酸性土壤的改良劑來中和土壤酸度，提高土壤的pH值。隨著高碳基土壤修復肥施用量的增加，土壤根際土壤有機質、速效磷、有效鉀和水解性氮含量逐漸增加，T3和T4處理間差異不顯著，表明高碳基土壤修復肥能夠有效改良土壤，提供土壤養分，但施用量過多會降低改良土壤的效率。

表4 高碳基土壤修復肥對土壤養分含量的影響

2.3 高碳基土壤修復肥對煙草生長發育的影響

2.3.1 高碳基土壤修復肥對煙株光合作用的影響 煙葉既是煙株的營養器官又是其經濟器官，因此，個體與群體的光合作用決定著煙株的生長、發育和產量品質形成。N能增加葉面積和葉綠素含量，P、K能加速葉片內碳水化合物的轉化，故施肥能提高光合作用。表5顯示T3處理的光合速率最大，而T4處理的光合速率小于T2和T3，表明高碳基土壤修復肥施用量過大不利于光合作用，適當的高碳基土壤修復肥施用量和重茬抗病肥配合施用的效果最佳。

表5 高碳基土壤修復肥對煙株光合特性的影響

2.3.2 高碳基土壤修復肥對煙株生長發育的影響 根系是煙株吸收土壤中水分和養分以及合成生物堿的重要器官，其大小、分布及活力對煙株的生長發育及煙葉產量、品質有著很大的影響，施肥與土壤環境會影響根系的生長和分布[17]。表6顯示T3處理煙株地下部和地上部的干重、干鮮比均最大，表明高碳基土壤修復肥和重茬抗病肥配合施用能夠明顯促進煙株的生長發育。

表6 高碳基土壤修復肥對煙株生長發育的影響

2.3.3 高碳基土壤修復肥對烤煙農藝性狀的影響 表7顯示了不同處理中煙株的生長性狀，從中可以看出， T3處理的株高、莖圍、葉長和葉寬均大于其它處理。T0、T1、T2、T3處理相比較發現，隨著高碳基土壤修復肥施用量的增加，株高、莖圍、葉長和葉寬等性狀逐漸增大，但是T4處理的株高、莖圍、葉長和葉寬小于T1、T2、T3，表明高碳基土壤修復肥施用量不宜過高。

表7 高碳基土壤修復肥對煙株農藝性狀的影響

2.4 高碳基土壤修復肥對烤煙根系養分吸收相關基因表達的影響

根系-土壤微生物互作能夠促進植物對養分的吸收。植物體內銨轉運蛋白、離子轉運蛋白、硝酸鹽轉運蛋白和磷酸鹽轉運蛋白調節著植物對N、P、K的吸收，維持它們在植物體內的穩定并使土壤中N、P、K得到高效利用。上述結果顯示T3處理的煙株生長發育明顯好于其他處理，因此進一步分析了T3和對照煙株根系養分吸收相關基因的表達情況。圖6顯示，T3處理的高親和性銨轉運蛋白、高親和性鉀離子轉運蛋白、高親和性硝酸鹽轉運蛋白和磷酸鹽轉運蛋白的表達明顯高于對照，說明T3處理能夠促進煙株對土壤N、P、K的吸收與利用。

ATM：高親和性銨轉運蛋白；HAK：高親和性鉀離子轉運蛋白；NRT：高親和性硝酸鹽轉運蛋白；PT：磷酸鹽轉運蛋白。圖6 高碳基土壤修復肥對烤煙根系養分吸收相關基因表達的影響

3 討論與結論

土壤微生物區系的惡化失調是煙草連作障礙發生的重要原因。生物炭能通過多種機制影響土壤細菌活性與數量。本研究發現，高碳基土壤修復肥能顯著增加煙田土壤細菌的數量，降低真菌數量，這與黃瓜、水稻栽培上的結果類似[18-19]。生物質炭不僅能為土壤細菌提供更多的C源，其特殊的孔隙結構又為土壤細菌的生長提供良好的生境，增加了根際有益微生物數量，而這些有益菌對部分土壤病原真菌又有直接的拮抗作用，可減少真菌的數量[20-21]。

土壤pH影響著煙株對養分的吸收，生產優質煙葉的最適土壤pH是5.5～7.0。連作使得土壤嚴重酸化，根際土壤pH隨著連作年限的增加而逐漸下降，連作6年時已低于最適范圍。本研究表明高碳基土壤修復肥可以中和土壤酸度，提高土壤的pH值，同時也能提高土壤酶活性與養分，促進煙株生長發育。

近年來的研究表明，生物質炭能夠通過改變土壤物理化學性質、增加土壤養分、改變根際土壤微生物群落結構、降解或抑制連作障礙有害物質的毒害效應、改變次生代謝產物的遷移，進而改善根系對土壤養分和水分的吸收、促進作物生長[22]。本研究結果顯示，高碳基土壤修復肥能夠促進煙株地下部和地上部的生長發育，尤其是高碳基土壤修復肥和重茬抗病肥配施效果更加顯著，表現出協同效應。這一方面是由于高碳基土壤修復肥的促進作用；另一方面重茬抗病肥能夠清除連作土壤積毒，抑殺土傳病蟲害，提高土壤肥料利用率，補充土壤養分，促進煙草生長發育。高碳基土壤修復肥和重茬抗病肥配施時，高碳基土壤修復肥含有的易分解的有機物質可以為重茬抗病肥中的微生物提供碳源和氮源，同時其含有的生物質炭的多孔隙結構能夠為微生物提供附著位點和較大的生存空間。因此，兩者配施可以發揮協同增效作用。

植物表型是基因表達調控的結果，既然高碳基土壤修復肥能夠促進煙株的生長發育，其基因表達勢必會發生改變。生物質炭不僅能夠促進水稻葉片中蛋白質代謝相關基因的表達，也被發現能夠提高番茄抗性基因的表達[23-24]。本研究發現高碳基土壤修復肥能夠顯著提高煙株根系養分吸收相關基因的表達，表明高碳基土壤修復肥促進了煙株對土壤N、P、K的吸收與利用。

綜上所述，高碳基土壤修復肥和重茬抗病肥配施能夠增加烤煙連作土壤中根際土壤細菌數量，降低根際真菌數量，改善土壤微生物群落結構，提高土壤pH和土壤酶活性，增加土壤養分含量，增加根系養分吸收相關基因的表達，提高養分吸收利用效率，促進煙株生長發育。