爆震傷對大鼠神經功能的損傷作用及機制探討

劉彤 任憲奔 李營 韓守孟 張為 李明昌

爆震傷(即沖擊傷)是指沖擊波擊中時釋放出的能量而造成的各種損傷,是戰爭中最常見的損傷。顱腦爆震傷與其他創傷相似，但又有其特殊性，能引起神經功能障礙。本研究通過建立顱腦爆震傷大鼠模型，檢測爆震傷對大鼠神經功能的損害作用，探討其初步機制，為顱腦爆震傷的防治提供一種可靠的動物模型。

材料與方法

1.實驗材料：水合氯醛(武漢谷歌試劑公司)，免疫熒光抗體TUNEL試劑盒(Roche)，免疫組化抗體ZO-1(三鷹公司)，50g當量圓柱狀TNT炸藥(北京理工大學爆炸科學與技術國家重點實驗室)，高速相機圖像采集系統(北京理工大學爆炸科學與技術國家重點實驗室)。

2.實驗動物分組：選擇健康雄性SD大鼠32只，體重200～220 g，由北京維通利華實驗動物中心提供。采用隨機數字表法分成對照組和模型組，模型組每組依據距離爆源遠近(分別為0.4 m，0.5 m，0.6 m，0.7 m處)各隨機放置4只大鼠，分別為模型組1、2、3、4小組，對照組4只放置在同一現場遠處，無爆源影響。顱腦爆震傷模型2小時后，行神經行為學評分，然后取大鼠腦組織進行研究。

3.實驗方法：動物模型制備：TNT爆炸后無金屬彈片，完全由爆炸沖擊波釋放能量，造成大鼠腦部單純爆震傷。 神經行為學評分：大鼠神經功能評分采用改良Garcia，同一單盲者在造模后2小時進行評估，分為6項指標進行評分(0～3或1～3分)，具體包括：(1)自主活動；(2)四肢活動；(3)提尾時前爪伸展；(4)攀爬抓持；(5)軀干兩邊的觸摸反應；(6)大鼠觸須反應。最多18分，最少零分。評分越低，說明神經功能越差。 爆炸沖擊波強度數據計算：在爆炸試驗中，圓柱形炸藥的質量為50 g，炸藥直徑為30 mm，炸藥高度為43.4 mm。本研究利用商用有限元軟件ANSYS/AUTODYN對實驗結果進行數值模擬。模擬計算出距離爆原不同距離位置處沖擊波的超壓峰值及產生的沖量。

4.TUNEL雙標免疫熒光法檢測大鼠神經細胞凋亡，熒光顯微鏡下觀察并拍照記錄。

5.免疫組化檢測ZO-1蛋白表達，對比各組組內及組間腦組織ZO-1蛋白表達量差異。

三、統計學分析

結果

1.爆震傷后神經行為學評分變化:與對照組相比，爆震傷各組神經行為學評分均明顯的下降。離爆源越近大鼠傷勢越重，評分越低，表明爆炸沖擊波隨距離逐漸衰減，距離越近爆炸沖擊波對大鼠造成的損傷越嚴重，距離越遠對大鼠損傷越輕微。對照組神經行為學評分為(18±0.00)分，爆震傷1組為(0±0.00)分，爆震傷2組為(10±0.41)分，爆震傷3組為(12±0.82)分，爆震傷4組為(17±0.41)分。我們選取爆震傷組2(距離爆源0.5 m)作為實驗組進行后續實驗。

2.爆炸沖擊波強度數據采集:利用商用有限元軟件ANSYS/AUTODYN對實驗結果進行數值模擬。首先利用AUTODYN-2D中的多材料歐拉公式對空氣區域進行建模，得到包含空氣和高爆藥的楔體，共設置6個測點，測點到雷管點的距離分別為0.4 m、0.5 m、0.6 m、0.7 m、0.8 m、0.9 m。超壓計算結果見表1。

表1 超壓計算結果

3.爆震傷后腦組織神經元凋亡情況:對照組凋亡率為(3.5±1.21)%，爆震傷組為(55.4±4.25)%，兩組比較差異有統計學意義(P<0.05)。見圖 1。

a：對照組神經細胞凋亡染色(TUNEL雙標免疫熒光法，×40)

4.ZO1蛋白表達變化:對照組ZO-1陽性率為(28.3±3.47)%，爆震傷組(4.8±1.26)%，兩組比較差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

a：對照組腦組織ZO-1(免疫組化，×40) b：爆震傷組腦組織ZO-1(免疫組化，×40)

討論

顱腦爆震傷是炸藥爆炸所產生的高壓波作用于頭面部，造成神經系統損傷。爆震傷在短時間內發生多重的、嚴重的腦震蕩。相關統計數據表明，在伊拉克、阿富汗的局部戰爭中，有約3萬士兵遭遇過爆震傷[1]，克羅地亞戰爭中，顱腦爆震傷約占頭部受傷人數的一半[2]。近年來，爆震傷的發生率逐年遞增[3]。

爆震傷致傷機制復雜，普遍認為血腦屏障通透性增加和炎癥反應是爆震傷最重要的病理生理機制。有研究表明，由腦微血管內皮細胞和其他細胞表面的緊密連接蛋白如Claudins、Occludin、ZO、JAMs等之間組成的緊密連接(tight junction，TJ)是維持血腦屏障通透性最重要的結構基礎。血腦屏障在腦組織受損或缺血、缺氧和炎癥刺激下，引起血腦屏障通透性升高而引起腦水腫[4]。爆震傷者行為學障礙與血腦屏障通透性增加相關[5]，有動物實驗顯示，血腦屏障通透性在爆震傷后增加[6]。

本研究通過使用合適當量的TNT炸藥，建立一種質量穩定的大鼠爆震傷模型，真實地模擬了實戰當中爆震傷對傷者產生的損害。由于TNT爆炸無彈片產生，僅有氣浪沖擊波的作用。相對于其他致傷源而言，更大程度上復原了戰場爆炸沖擊波對受者頭部的損害過程。我們設置了不同距離的實驗組，與對照組比較，各實驗組大鼠均受到一定程度的神經功能損害。實驗組間距離爆源越近，損傷程度越明顯。0.4 m處大鼠全部死亡，0.5 m處大鼠損傷重。神經行為學評分明顯降低，0.6 m處大鼠損傷較重，神經行為學評分降低較明顯，0.7 m、0.8 m處大鼠損傷較輕，神經行為學評分改變較小。我們認為，0.4～0.5 m是大鼠具有極高死亡風險的距離，0.5～0.6 m是建立爆震傷大鼠模型適合的距離，如需建立穩定可靠的大鼠爆震傷模型可選用0.5～0.6 m距離。鑒于后續實驗需要，我們選用0.5 m作為爆震傷最適合的模型制作距離。

后續病理研究發現，與對照組比較，爆震傷組存在相對較高的神經細胞凋亡陽性率，表明爆震傷能通過損傷動物腦組織神經細胞，促進細胞凋亡的發生，進而引起神經功能障礙。ZO-1蛋白是反映血腦屏障通透性的關鍵分子，結果發現，實驗組大鼠腦組織ZO-1蛋白表達量低于對照組。與腦微血管內皮細胞和其他細胞表面的緊密連接蛋白如Claudins、Occludin、ZO、JAMs等之間組成的緊密連接是維持血腦屏障通透性最重要的結構基礎，ZO-1作為緊密連接的重要組成，其表達量明顯降低，表明爆震傷可能通過對血腦屏障的緊密連接分子造成破壞以及造成腦出血，引起血腦屏障通透性增加，產生炎癥及腦水腫等病理變化，進而造成顱腦神經功能障礙。該研究結果表明，對血腦屏障緊密連接分子ZO-1的有效保護[7],可能是預防和減輕爆震傷損傷的有效手段。TREM-1可能通過促進p38MAPK/MMP-9的激活和ZO-1的降解參與sah誘導的早期腦損傷(EBI)的發病機制，而TREM-1的抑制明顯減輕了EBI的嚴重程度，為EBI的治療提供了新的途徑[8]。ω-3魚油脂肪乳對重型顱腦創傷具有幫助恢復的作用[9]。