野菊花精油化學成分分析及其抑菌活性*

張知俠，高奕紅

(咸陽師范學院 化學與化工學院,陜西 咸陽 712000)

野菊花為多年生草本植物,多生長于路邊、山坡草地、荒野以及小樹林等野生地帶,為菊科菊屬植物野菊(ChrysanthemumindicumLamb)的干燥頭狀花序。野菊花是一味中藥，其全草皆可入藥，在中國各地均有分布，盛產于云南、四川等地區；野菊花性苦、辛涼，主要用于治療腫毒瘡癰，疏風散熱，多用于上呼吸道感染、流行性感冒的治療，還有降血壓，瀉火平肝等作用。野菊花的生物活性多樣，其成分中以精油、黃酮類、多糖、二萜類為主；現代藥理研究表明，野菊花提取物有較強的抗氧化能力、抗骨質疏松[1-2]，可降血糖、降血脂[3-4]，鎮痛消炎[5-7],還具有一定的抗抑郁作用[8-9]，在抗癌方面的研究也有新進展，野菊花提取物具有抗前列腺癌[10]，抗肝癌的作用[11]；其精油具有廣譜抗菌活性，能有效抑制白色念球菌、金黃色葡萄球菌、結核桿菌、白喉桿菌及大腸桿菌等細菌[12]。在植物保護方面的應用研究發現野菊花精油對植物病原菌煙草黑脛病菌[13]、蕎麥立枯絲核菌都表現出較強的抑制活性[14]。實驗對產自陜西咸陽本地的野菊花精油的化學成分及其抑菌活性進行研究，以期為有效開發野菊花資源，充分挖掘野菊花精油作為農藥的有效成分，為開發天然產物農藥提供理論依據。

1 實驗部分

1.1 原料、試劑與儀器

野菊花：采于陜西咸陽郊區山坡上，用其頭狀花序，經篩選干燥后粉碎過450 μm篩，置于-18 ℃冰箱中保存備用；辣椒疫霉病菌、番茄葉霉病菌、小麥赤霉病菌、番茄早疫病菌、水稻稻瘟病菌、黃瓜炭疽病菌、小麥紋枯病菌、蘋果炭疽病菌、棉花立枯病菌、玉米大斑病菌、番茄灰霉病菌：西北農林科技大學無公害農藥研究服務中心提供；培養基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)。

氯化鈉、石油醚、無水硫酸鈉：分析純，天津市河東區紅巖試劑廠；丙酮：濟南匯豐達化工有限公司。

氣相色譜-質譜聯用儀：GC-MS/QP2010，日本島津公司；智能型生化培養箱：SPX-150B，上海瑯玕實驗設備有限公司；全自動蒸汽滅菌鍋：D-1，上海喬躍電子科技有限公司；旋轉蒸發儀：R213，上海申生科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 野菊花精油提取

將在咸陽郊區采摘的新鮮野菊花進行篩選放入50 ℃烘箱烘干，t≈3 h，然后粉碎過450 μm篩。準確稱量45 g，置于1 000 mL圓底蒸餾燒瓶中，加500 mL蒸餾水浸泡4 h，按中華人民共和國藥典(2010年版)精油提取方法[15]連續蒸餾7.5 h。將所得餾出液用氯化鈉進行飽和，靜置一段時間后，將飽和的提取液用石油醚萃取其精油，反復萃取3次，分出醚層，然后把萃取液合并再加無水硫酸鈉干燥6 h,用旋轉蒸發儀濃縮干燥后的萃取液,用丙酮作溶劑，收集獲得野菊花精油0.372 g。

1.2.2 GC-MS分析

氣相色譜條件為島津CBP5-M25-025彈性石英毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；載氣為高純氦氣；柱流量1 mL/min,進樣量1 μL，柱初溫50 ℃,保溫2 min,以5 ℃/min升溫速率升至240 ℃,保留溫度5 min；進樣口溫度230 ℃;柱前壓55.5 kPa,分流比1∶50。

質譜條件為電子轟擊離子源(EI),離子源溫度200 ℃,電子能量70 eV,GC-MS接口溫度220 ℃，電子倍增器電壓0.97 V，溶劑峰切斷時間2.0 min,質譜檢測起測時間2.5 min。掃描模式為全掃描模式m/z，質量掃描范圍29～350,質譜圖計算機檢索數據庫：NIST 147。

1.2.3 抑菌活性測定

對選用的小麥紋枯病菌、辣椒疫霉病菌、小麥赤霉病菌等11種病原菌，采用生長速率法[16]測試野菊花精油的抑菌活性。配制野菊花精油丙酮溶液，首先配制ρ(野菊花精油丙酮)=1 500 mg/L溶液的母液，然后將該溶液稀釋配成ρ(野菊花精油丙酮)=1 000、750、500、250 mg/L的系列溶液后分別加入到配置好的PDA培養基中,置于培養皿，制成系列培養基平面,在該平面上對供試的11種病原菌分別進行接種,接種完成后輕置于已經設定好溫度的生化培養箱，在26 ℃的培養箱中培養72 h，取出后，分別用卡尺采用十字交叉法測量各供試病原菌其菌落生長直徑3次,取其平均值。根據公式(1)和公式(2)計算菌絲生長抑制率。

菌落生長直徑=2次直徑平均值-4.0(菌餅直徑)

(1)

菌絲生長抑制率=(對照菌落生長直徑-處理菌落生長直徑)/對照菌落生長直徑×100%

(2)

2 結果與討論

2.1 精油收率

用水蒸氣蒸餾法對采自陜西咸陽郊區山坡的野菊花進行精油提取，得到的野菊花精油為淡黃色有辛香味的油狀液體，計算出精油的產率為0.827%。

2.2 精油化學成分的GC-MS分析

按前述的實驗方法及條件,對野菊花精油的化學成分用GC-MS聯用儀進行分析,得到總離子流圖，見圖1。

t/min圖1 野菊花精油總離子流圖

對總離子流圖中各個化合物質譜圖譜應用SHIMADZU GCMSsolution Release 2.10專業分析軟件，NIST147數據庫進行檢索,比較其質荷比、基峰和相對豐度，結合解析相關圖譜，按峰面積歸一法計算確定各組成化合物的相對含量；通過與標準譜圖對照、分析,確定出的野菊花精油的成分有43種,占總餾出峰面積的88.36%，見表1。

表1 野菊花精油化學成分

續表

由表1可知，其成分相對含量最高的是2-甲基二十烷，其次是左旋樟腦、桉油醇、十八烷、8-己基十五烷、反式-α-香檸檬烯。還含有少量其他的烴類、醇類、酯類、酸類、烯類等。

2.3 野菊花精油抑菌活性測試

野菊花精油用生長速率法對供試的11種病原菌進行測試，實驗結果見表2。

由表2可知，野菊花精油對供試的11種病原菌抑菌作用都有差異，在提供的劑量下大多與ρ(野菊花精油丙酮)呈正相關。其對小麥紋枯病菌的抑制率最強，其系列ρ(野菊花精油丙酮)對應的抑制率達到95%，對番茄葉霉病菌、玉米大斑病菌的抑制率高于80%，僅次于小麥紋枯病菌；對黃瓜炭疽病菌、番茄早疫病菌稍低一些，而對辣椒疫霉病菌和小麥赤霉病菌的抑菌率在不同ρ(野菊花精油丙酮)時幾乎不變，對其他幾種病菌也有相對較低的抑制率。

表2 野菊花精油對11種病原菌的抑制率

3 結 論

利用水蒸氣蒸餾法提取野菊花精油。通過GC-MS聯用儀對其精油進行化學成分分析，鑒定出43種成分，占總餾出峰面積的88.36%。檢測得到野菊花精油化學成分相對含量最高為2-甲基二十烷，其次為左旋樟腦、桉油醇、十八烷、8-己基十五烷、反式-α-香檸檬烯。還含有少量其他的烴類、醇類、酯類、酸類、烯類等。研究與何小珍[17]和Jing Chang-Liang[18]等對野菊花成分研究的結果有較大的差異，其主要原因是野菊花品種的多樣性以及不同的提取方法、產地、氣候、土壤等因素都有一定關系。同時，該實驗用野菊花精油對供試的11種病原菌的抑菌實驗測定表明，其精油對小麥紋枯病菌的抑制率最強，抑制率達到95%，對番茄葉霉病菌、玉米大斑病菌的抑制率高于80%，對其他的病原菌都有不同程度的抑制率。這和前期劉曉丹[19]等研究的野菊莖葉揮發油對植物病原真菌抑制作用強度略有不同，其原因與野菊的部位、產地等不同有關。由此可見，野菊花精油含有重要的抑菌活性成分，希望在繼續的研究中分離這些活性成分,并進一步做抑菌實驗，有可能發現具有新型殺菌活性的先導化合物，為新型抑菌農藥的創制奠定良好的基礎。