腎茶黃酮通過ERK/CT-1通路治療急性腎衰模型鼠氧化應激的實驗研究

郭銀雪 葛平玉 胡茂蓉

摘要 目的：觀察腎茶黃酮對急性腎衰（Acute Renal Failure，ARF）模型鼠氧化應激水平的干預效應，同時觀察其對ERK/CT-1通路的影響。方法：將36只急性腎衰模型大鼠隨機分為模型組和腎茶黃酮觀察組，每組18只，另設假手術組18只。連續腎茶黃酮干預7 d后比較各組大鼠肝腎功能、丙二醛（MDA）含量及超氧化物歧化酶（SOD）活性、腎組織ERK、p-ERK、CT-1水平的變化。結果：腎茶黃酮可明顯降低ARF模型鼠腎質量、腎質量/體質量，改善大鼠肝大和鼠蛋白尿、血漿肌酐、尿素氮水平，減少MDA含量，上調SOD活性，增加腎組織p-ERK、CT-1水平。結論：腎茶對急性腎衰有明顯治療作用，可能通過ERK/CT-1通路介導腎保護效應。

關鍵詞 急性腎衰;模型鼠;氧化應激;MDA;SOD;ERK;CT-1

Abstract Objective：To observe the intervention effects of kidney tea flavonoids on oxidative stress in rats with acute renal failure（ARF）and its effect on ERK/CT-1 pathway.Methods：A total of 36 rats with acute renal failure were randomly divided into a model group（n=18），and a kidney tea flavonoid treatment group（n=18）and a sham operation group（n=18）.The changes of liver and kidney function，malondialdehyde（MDA）content，superoxide dismutase（SOD）activity，renal tissue ERK，p-ERK and CT-1 levels were compared after continuous kidney tea flavonoids intervention for 7 days.Results：Kidney tea flavonoids could significantly reduce the kidney weight and kidney weight/body weight of ARF model rats，improve the levels of proteinuria，plasma creatinine and urea nitrogen，reduce the content of MDA，increase the activity of SOD and increase the levels of p-ERK and CT-1 in renal tissue.Conclusion：Kidney tea has obvious therapeutic effects on acute renal failure，which may be mediated by ERK/CT-1 pathway.

Keywords Acute renal failure; Model mice; Oxidative stress; Malondialdehyde; Superoxide dismutase; ERK; CT-1

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.18.006

急性腎衰竭（Acute Renal Failure，ARF）是臨床常見疾病，腎小管上皮細胞由于各種原因引起細胞的缺失或死亡是導致ARF發生的重要原因[1-2]。有研究顯示在缺血缺氧狀態下腎臟組織會產生過量的氧自由基，不但會導致酶活性蛋白質的功能受損，而且還可攻擊核基因轉錄過程影響細胞表型，導致腎臟細胞發生過度凋亡而影響腎功能[3-4]。因此我們推斷，某種干預措施如果可改善氧化應激狀態，則可減輕ARF腎損害。有研究顯示ERK/CT-1通路與機體氧化應激狀態密切相關，激活該通路活性可緩解氧化應激引起的細胞凋亡。

腎茶又名貓須草，腎茶黃酮為中藥腎茶的主要提取物，味苦、涼。目前大量研究資料[5-7]均證實腎茶黃酮可明顯增加腎小球數量，改善腎小管組織形態，減輕ARF的腎損害程度，但其作用機制目前尚無統一定論，因此我們進行動物模型實驗，以期進一步探討腎茶改善ARF的作用機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 66只雄性清潔級級Sprague Dawley（SD）大鼠，體質量（220±109）g，鼠齡（58±2）d。所有大鼠貴陽醫學院提供實驗動物中心提供，所有大鼠均接受同批次標準飼料喂養，實驗均在每日上午8：00-11：30時間段進行，保持環境安靜、通風，溫度（22±2）℃，相對濕度（55±2）%。各組大鼠在體質量、鼠齡等方面經統計學分析，差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性。

1.1.2 藥物 腎茶，又名貓須草，樣本購自衡陽森本生態農業科技發展有限公司（注冊號：430400000079085，批號：892834），總黃酮由貴陽中醫學院按照標準進行提取。提取方法：取10 g腎茶，加入100 mL飲用水后置于微波爐內加熱至徹底沸騰后進行循環提取120 min，充分過濾后收集藥液，隨后加80 mL于藥渣中，再次置于微波爐內加熱至徹底沸騰后進行循環提取120 min，充分過濾后收集藥液，后將2次提取的藥液濃縮至浸膏[1.26～1.45（70 ℃）]，后將浸膏烘干、打磨成細粉，最終形成腎茶提取物（濃度為每1 g腎茶提取物相當于4.7 g生藥），密封儲存。

1.1.3 試劑與儀器 ERK一抗抗體（CST公司，美國，貨號：4695T）、p-ERK（CST公司，美國，貨號：4370T）、β-actin一抗（CST公司，美國，貨號：3700T）、MDA ELISA試劑盒（上海科敏生物科技有限公司，貨號：KB2925）、SOD ELISA試劑盒（上海科敏生物科技有限公司，貨號：E-EL-R0929）。渦旋振蕩儀（上海珂淮儀器有限公司，型號：M392）;蛋白電泳及轉膜系統（Bio-Rad公司，美國，型號：B7483）;臺式高速離心機（Eppendorf，德國，型號：5430）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 分組：健康生長1周后，將實驗動物隨機分為假手術組，模型組和腎茶黃酮觀察組，每組18只。造模方法：術前禁食6 h并稱重，用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉SD大鼠（0.4 mL/100 g）后，使大鼠仰臥位固定于手術臺上，腹部備皮后以碘伏消毒液局部消毒，暴露手術區域。沿腹正中線縱行切口打開腹腔，用生理鹽水浸濕的無菌紗布牽開腹腔臟器，先暴露右腎，以1號泰絲線分別結扎整個腎蒂和右輸尿管并切除右腎;游離左腎，用無創傷動脈夾夾閉左腎動脈，并開始計時，觀察左腎顏色：由紅潤變為蒼白表示夾閉有效。1 h后松夾恢復左腎灌注，此時腎臟顏色恢復紅潤，提示再灌注成功。觀察術野無出血和滲血后逐層縫合關閉腹腔，用碘伏消毒液再次消毒傷口后肌肉注射青霉素（6萬U/100 g）2 d。假手術組僅切除右側腎臟后關腹。

1.2.2 給藥方法 腎茶黃酮組于再灌注24 h后開始腹腔注射腎茶黃酮配比液2 mL（用0.9%生理鹽水稀釋，生藥量為0.1 g/1 mL），2次/d。空白組及模型組大鼠接受2 mL生理鹽水干預。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 肝、腎功能檢測 干預結束后隨機選取3只/組大鼠，心臟采血4 mL，注入10 mL離心管中，予低速離心機（3 000 r/min）中，離心半徑5 cm，離心10 min分離血清，低溫保存，全自動生化儀及時檢測。

1.2.3.2 用免疫組化法測定各組腎組織CT-1水平變化 常規脫蠟水化，一抗為兔抗大鼠CT-1抗體（1∶50稀釋），二抗為生物素化羊抗兔IgG（1∶100稀釋），以PBS代替一抗作陰性對照，DAB顯色，胞質呈棕黃色或棕褐色顆粒的細胞為陽性表達細胞，光鏡觀察陽性信號。應用圖文分析報告系統在大鼠病變區域隨機采集10個視野（×200倍），每個視野計數100個細胞，總計1 000個細胞，計算出平均陽性率，以百分率（100%）表示陽性細胞數，即得。

1.2.3.3 用ELISA檢測法測定各組外周血MAD、SOD水平變化 于最后1 d干預結束后每組隨機抓取3只大鼠，取其腹主動脈血5 mL，高速離心后取出上清液，用相應的ELISA試劑盒對各組細胞的MAD、SOD水平進行檢測，具體步驟如下：將樣本加入ELISA反應孔板中，4 ℃過夜。第2天棄去孔內溶液，加入PBS洗滌2次，3 min/次，同時設置空白對照孔，再加入的酶標抗體的酶標抗體，室溫下孵育1 h后加入PBS洗滌2次，3 min/次。反應結束后先后于空中加入0.1 mL的TMB及0.05 mL的2M硫酸，最后用酶聯免疫檢測儀測定各孔的吸光值（OD值）。操作過程完全按照說明書進行。

1.2.3.4 用Western Blot測定各組中腎臟組織ERK、p-ERK水平變化 于最后1 d干預結束后每組隨機抓取3只大鼠，充分麻醉后處死，取中縫背核組織200 mg加1 mL裂解緩沖液，4 ℃，15 000 r/min，離心5 min，離心半徑10 cm，冰浴中超聲，20 s/次，間隔20 s，共5次，1 h取上清，取25 μL測蛋白含量。BCA法測蛋白濃度，用凝膠加樣緩沖液將各管蛋白濃度調為一致（2 mg/mL），取20 μL樣品煮沸5 min。電泳（5%濃縮膠，12%分離膠，60 V，40 mA，2.5 h）結束后將凝膠取出，進行轉膜，遵循膠在負極，膜在正極的原則，100 V，250 mA，時間依據各指標分子量大小而定，將硝酸纖維素膜取出，用麗春紅對固定于硝酸纖維素濾膜上的蛋白質進行預染，看電泳帶是否清晰，證實蛋白質確實轉移到膜上。5%脫脂奶粉封閉2 h，TBST洗3次，5 min/d，分別加入抗ERK、p-ERK、β-actin一抗抗體孵育，4 ℃過夜TBST洗2次，5 min/次，加入辣根過氧化物酶標記與一抗相抗的二抗IgG（1∶2 000）室溫50 min，TBST洗3次，5 min/次。將濾膜放人配好的顯色液中反應1 min，計算機掃描圖像，并由生物圖像分析系統（Bio-Rad公司，美國，型號：Model Gel Doc 2000）分析處理。

1.3 統計學方法 采用SPSS 22.0統計軟件對研究數據進行統計分析，計量資料用均數±標準差（±s）表示，采用t檢驗;計數資料用百分比（%）表示，采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠腎質量、腎質量/體質量的變化比較與假手術組比較，造模組大鼠腎質量、腎質量/體質量均明顯升高，差異有統計學意義（P<0.05）;與模型組比較，腎茶黃酮觀察組腎質量、腎質量/體質量均明顯下降，差異有統計學意義（P<0.05）。見表1。

2.2 各組大鼠蛋白尿、腎功能變化比較 對各組大鼠24 h蛋白尿及腎功能指標進行檢測，結果顯示接受ARF模型制備的大鼠蛋白尿、血漿肌酐、尿素氮水平明顯增加，與假手術組比較，差異有統計學意義（P<0.05），經腎茶黃酮治療后大鼠蛋白尿、血清肌酸酐和尿素氮含量顯著減少，與模型組比較，差異有統計學意義（P<0.05）。見表2。

2.3 各組大鼠血脂水平變化比較 與假手術組比較，經過ARF模型制備后大鼠血漿總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇均明顯下降，差異有統計學意義（P<0.05），與模型組比較，腎茶黃酮觀察組上述指標均明顯下降，差異有統計學意義（P<0.05）。見表3。

2.4 各組大鼠氧化應激水平變化比較 與假手術組比較，經過ARF模型制備后大鼠SOD活性明顯下降，MDA含量明顯升高，差異有統計學意義（P<0.05），經過腎茶黃酮治療后大鼠SOD水平上調，MDA表達下降，與模型組比較，差異有統計學意義（P<0.05）。見表4。

2.5 各組大鼠中腎臟組織ERK、p-ERK、CT-1水平變化比較 經過Western Blot檢測可知各組大鼠腎臟組織ERK/β-actin比值相仿，差異無統計學意義（P>0.05），與假手術組比較，經過ARF模型制備后大鼠腎臟組織p-ERK、CT-1水平下降，差異有統計學意義（P<0.05），經過腎茶黃酮治療后大鼠p-ERK、CT-1表達上調，與模型組比較，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖1、圖2、表5。

3 討論

ARF是目前備受關注的公共健康問題，一旦ARF控制不理想將出現病情急速惡化，甚至引發其他系統的嚴重并發癥。腎切除是目前較為符合人類ARF病理變化的動物模型，在本研究中我們發現造模大鼠的腎臟在術后明顯增大，這可能與腎臟組織缺血缺氧后腎小管上皮細胞變性壞死，導致其基底膜連續性受破壞，產生斷裂，由此腎小管內液反流至間質，從而出現腎間質性水腫，從而引起腎臟體積變大[8-9]。氧化應激是CRF的已知特征，其中SOD及MDA是目前最具代表機體氧化應激水平的指標。SOD廣泛分布于生物體內，其中腎臟尤為凸顯，是清除氧自由基的主要酶類物質。MDA是脂質過氧化作用后的產物，其水平高低直接標志機體氧自由基水平。大量動物模型實驗證實，SOD及MDA和ARF疾病發生發展關系密切，過度表達的氧自由基通過脂質過氧化作用對腎小球產生損害作用，而脂質過氧化作用又是激活纖維細胞產生膠質的生物過程，從而導致機體腎小球系膜區的膠原分泌增多致沉積，導致腎間質纖維化產生，破壞了腎組織的正常結構及形態，影響了腎功能的正常運行。腎臟局部組織中固有細胞及浸潤細胞分泌過量的氧自由基，且抗氧化酶如SOD濃度下調，從而出現氧自由基與抗氧化物酶之間的動態平衡受破壞，從而逐漸產生了上述ARF的病理改變，因此調節氧自由基在腎組織局部的生成及消除平衡是治療ARF的關鍵[10-12]。

腎茶乃貓須草之別稱，藥理學分析證實其含有迷迭香酸、迷迭香酸乙酯、熊果酸等化學成分[13-15]。中醫角度認為腎茶味苦性含寒涼，是清熱解毒、利尿止血之良品，現代藥理學亦證實其有明顯改善腎功能的作用。BUN和Scr是臨床廣泛應用于衡量腎功能的重要指標，BUN主要由肝臟合成，腎臟排泄，與腎小球濾過率密切相關;血漿Scr由肌組織中磷酸肌酸分解產生，亦由腎臟排泄，在一定程度上亦體現了腎小球濾過率，故BUN及Scr均是間接體現腎臟損傷程度的重要因子。本研究通過動物模型證實腎茶確可明顯減少蛋白尿的釋放，降低BUN及Scr的水平，這充分說明腎茶可明顯改善腎功能，與國內外諸多文獻結果一致[16-18]。

有研究顯示在缺血缺氧狀態下腎臟組織產生大量的氧自由基會攻擊腎臟組織細胞的脂質、DNA遺傳物質以及蛋白質等大分子，從而導致腎臟組織細胞過度凋亡。有資料[19]顯示在機體缺血缺氧狀態時CT-1可發揮反饋性保護效應，一旦ERK/CT-1通路被抑制則導致機體對抗氧化性損害的能力減弱，導致細胞過度凋亡，影響細胞活性。本研究顯示造模大鼠的腎臟組織的ERK/CT-1通路標志性因子的表達被抑制，經過腎茶干預后大鼠的p-ERK及CT-1表達均上調，因此我們有理由相信腎茶可通過激活ERK/CT-1通路而實現保護ARF機體的腎功能。

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（2019-10-10收稿 責任編輯：王楊）