糖腎煎對2型糖尿病腎病大鼠的腎保護實驗研究

晏玲 胡愛民 張利芳

摘要 目的：探討糖腎煎對2型糖尿病腎病（DN）大鼠的腎保護作用。方法：采用單腎切除+高脂飼料+小劑量鏈脲佐菌素（STZ）腹腔注射，結合行為干預（饑飽失常、勞逸無度、驚嚇）建立2型DN氣陰兩虛型證大鼠模型，共60只。按照隨機數字表法隨機分為A組（假手術）、B組（模型）、C組（糖腎煎）、D組（貝那普利），每組15只。檢測各組大鼠干預處理后血糖[空腹血糖（FBG）、餐后2 h血糖（PBG）]、尿素氮（BUN）、血肌酐（Cr）、24 h尿白蛋白（24 h-UAlb）、胱抑素c（Cys-c）及血、尿β2微球蛋白（β2-MG），比較各組大鼠腎組織病理特征。結果：與A組比較，B組BUN、Cr升高并不顯著（P>0.05），FBG、PBG、24 h-UAlb、Cys-c及血、尿β2-MG均明顯上升（P<0.05）;與B組比較，C、D組24 h-UAlb、Cys-c及血、尿β2-MG均有明顯降低（P<0.05）;C、D 2組上述指標差異無統計學意義（P>0.05）;腎臟組織病變程度由正常～嚴重依次為A組、C組、D組、B組。結論：中藥復方糖腎煎能有效降低2型糖尿病腎病大鼠的血糖、24 h-UAlb、Cys-c及血、尿β2-MG，發揮腎保護作用。

關鍵詞 2型糖尿病腎病;大鼠模型;氣陰兩虛型;糖腎煎;血糖;血清胱抑素C;β2微球蛋白;腎保護

Abstract Objective：To explore the renal protective effects of Tangshen Decoction on type 2 diabetic nephropathy（DN）rats.Methods：A total of 60 type 2 diabetic nephropathy rats with deficiency of both qi and yin were established by single nephrectomy，high fat diet and small dose of streptozotocin（STZ）intraperitoneal injection combined with behavioral intervention（hunger and satiety disorder，excessive work and rest，fright）and were randomly divided into a group A（sham operation），a group B（model），a group C（Tangshen Decoction）and a group D（benazepril），with 15 rats in each group.Fasting blood glucose（FBG），2 h postprandial blood glucose（PBG），urea nitrogen（BUN），serum creatinine（CR），24-hour urinary albumin（24 h UAlb），Cystatin C（Cys-C），blood and urine β 2-microglobulin（β 2-mg）were detected after intervention.The pathological characteristics of renal tissue were compared between the 2 groups.Results：Compared with group A，BUN and Cr in group B did not increase significantly（P>0.05），FBG，PBG，24 h-UAlb，Cys-c，blood and urine β2-MG increased significantly（P<0.05）; compared with group B，24 h-UAlb，Cys-c，blood and urine β2-MG in group C and D decreased significantly（P<0.05）; the above indexes in group C and group D had no statistical significance（P>0.05）; renal tissue lesions from normal to severe were A group，C group，D group，B group.Conclusion：Tangshen Decoction，the Chinese patent medicine can effectively reduce blood sugar，24 h-UAlb，Cys-c，blood and urine group β2-MG in type 2 diabetic nephropathy rats，and has protective effects on early DN kidney.

Keywords Type 2 diabetic nephropathy; Rat model; Deficiency of both qi and yin; Tangshen Decoction; Blood glucose; Serum cystatin C; β2-microglobulin; Renal protection

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.18.005

糖尿病腎病（Diabetic Nephropathy，DN）是糖尿病的常見并發癥，也是導致終末期腎病的重要原因，全國調查慢性腎功能衰竭的主要病因，糖尿病因素居第2位。絕大部分早期腎損害患者無臨床癥狀或缺乏特異性，尿常規檢查和腎功能檢查也多無異常，給早期診治帶來較大困難。近些年有研究表明在DN早期，血清胱抑素c（Cys-c）與血、尿β2微球蛋白（β2-MG）上升更早于血清尿素氮（BUN）和血肌酐（Cr），可作為早期DN診斷及療效評價的敏感指標[1]。目前尚無治療DN的特效療法，臨床常用的有運動、飲食療法、預防“3高”（血壓、血糖、血脂）等治療和預防方法，但療效不盡理想，因此關于早期DN的治療方案探究一直是臨床研究的熱點[2]。糖腎煎是治療2型糖尿病腎病的經典方劑，臨床相關文獻也較多，但對于其腎保護作用機制有待深入探討，此外相關病理觀察方面的報道也較少。本研究建立早期2型糖尿病腎病氣陰兩虛病證結合實驗模型，探討運用中藥復方糖腎煎對2型DN大鼠血糖、BUN、Cr、24 h尿白蛋白（24 h-UAlb）、Cys-c及血、尿β2-MG的影響，評價糖腎煎糖腎煎對2型糖尿病腎病的治療作用，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 本次實驗共收集SPF級Wistar雄性大鼠共60只，體質量大鼠100～130 g，平均體質量（114.5±10.6）g，均購自湖北省疾病控制中心實驗動物中心[動物許可證號：SCXK鄂2016-0150，倫理審批號：醫研倫審（2016）第04號]，基礎飼料飼養，飲用消毒無菌水。

1.1.2 藥物 糖腎煎由生黃芪、太子參、生地黃、山藥、山茱萸、茯苓、牡丹皮、五味子、赤芍、三七等中藥組成，用“水煮醇提法”制備成浸膏，用生理鹽水稀釋成含生藥2.5 g/mL的溶液。貝那普利（諾華制藥，國藥準字20000292），10 mg/片。脂飼料配制：按照基礎飼料87.5%、豬油10%、膽固醇粉2%、膽酸鈉粉0.5%0.5%的比例混合配制。

1.1.3 試劑與儀器 血糖檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20091201）;BUN、Cr檢測試劑盒（北京恩濟和生物有限公司，批號：A141201、A141203）;β尿2-MG試劑盒（深圳新產業生物醫學工程股份有限公司，批號：031150115）;尿微量白蛋白（umAlb）試劑盒（山東博科生物產業有限公司，批號：20141205E）。穩豪血糖儀（強生公司，美國，型號：one Touch Ultrall），全自動生化分析儀（雅培公司，美國，型號：CD-1600），顯微鏡（奧林巴斯公司，日本，型號：BX-51）和圖像采集系統（奧林巴斯公司，日本，型號：DP70）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 60只大鼠適應性喂養7 d后進行血糖、血壓、血脂、體質量等常規測量，均確保無指標異常大鼠。隨機選取其中15只大鼠作為A組（假手術），余下45只作為模型制備對象，分成B組、C組和D組15只。參考文獻[3-4]建立2型糖尿病腎病“氣陰兩虛證”大鼠模型，具體方法：1）單腎切除：除A組外，大鼠常規1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉消毒后，行背部切口1.5 cm，剝離腎臟脂肪、腎上腺，左腎門血管結扎，切除左腎后縫合切口，術后常規處理。A組行切口后僅暴露左腎、縫合切口處理。2）高脂飼料：除A組外，單腎切除術后7 d給予高脂飼料正常喂養，A組給予基礎飼料喂養，持續2周。3）鏈脲佐菌素（STZ）腹腔注射：除A組外，均給予STZ 30 mg/kg腹腔注射，A組注射等劑量0.1 mmol/L檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液。72 h后行OGTT試驗，血糖儀檢測FBG≥5.6 mmol/L或負荷后2 h血糖≥7.8 mmol/L表示模型初步建立。4）行為干預：除A組外，采用饑飽失常、勞逸無度、驚嚇刺激等途徑干預。

1.2.2 干預方法 A組繼續常規飼養。C組給予中藥復方糖腎煎10 g/（kg·d）灌胃。D組采用貝那普利（諾華制藥）10 mg/（kg·d）灌胃處理，用生理鹽水稀釋成2 mg/mL的溶液灌胃。A、B2組給予飲用純凈水灌胃處理，灌胃純凈水體積同C、D 2組灌胃藥液體積，4組均連續灌胃處理20周。若研究中途有大鼠死亡則予以剔除。

1.2.3 檢測指標與方法 均于實驗結束前1 w采用金屬代謝籠收集24 h尿標本，記錄尿量后取10 mL尿標本。OGTT實驗結束后禁食12 h，以戊巴比妥鈉腹腔麻醉，腹主動脈取血，分離血清，以備檢測。血糖（FBG、PBG）測定用葡萄糖氧化酶法;BUN用尿素酶-谷氨酸脫氫酶法;Cr用酶法;umAlb用免疫透射比濁法;血、尿β2-MG用化學發光法;Cys-c用免疫比濁法，所有指標均嚴格按試劑盒說明書進行檢測。剝離摘取大鼠右側腎臟，冰生理鹽水清洗后吸干表面水分，10%福爾馬林固定72 h，制備4 μm石蠟切片，蘇木素伊紅（HE）染色，光鏡下觀察各組大鼠腎組織病理特征。

1.3 統計學方法 采用SPSS 22.0統計軟件對研究數據進行統計分析，計量資料用均數±標準差（±s）表示，先對計量資料進行正態性檢驗，當滿足正態分布和方差性時，組間比較采用t檢驗，若當不滿足正態分布則采用非參數檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 實驗模型大鼠基本情況 A組大鼠體態正常，進食、飲水、排泄、運動、睡眠等均正常，無死亡;B組大鼠體態衰弱，毛發稀少枯黃，四肢纖瘦乏力，少動嗜睡，排泄習慣及排泄物形態異常，死亡2只;C組大鼠體態稍次于A組，明顯優于B組，大鼠進食、飲水、睡眠習慣、排泄等基本正常，毛發略有干枯，顏色略微黯淡，運動量稍有減少，死亡1只;D組大鼠體態次于A組、C組，優于B組，大鼠進食、飲水、運動量有一定減少，排尿次數增多，毛發干枯稀少，毛發枯黃，四肢纖瘦乏力，死亡2只。

2.2 4組大鼠FBG、PBG指標比較 和A組比較，B、C、D組血FBG、PBG均顯著偏高，差異均有統計學意義（P<0.05）;和B組比較，C組血FBG、PBG明顯偏低，差異有統計學意義（P<0.05），和D組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見表1。

2.3 4組大鼠腎功能BUN、Cr、24 h-UAlb、Cys-c、血尿β2-MG指標比較 和A組比較，B、C、D組BUN、Cr均有升高，但差異均無統計學意義（P>0.05），B、C、D組24 h-UAlb、Cys-c、血尿β2-MG均顯著偏高，差異有統計學意義（P<0.05）;和B組比較，C、D組24 h-UAlb、Cys-c、血尿β2-MG均明顯降低（P<0.05或P<0.01）。見表2、表3。

2.4 4組大鼠腎組織病理特征 A組大鼠光鏡下清晰可見腎小管、小管間質區結構，腎小管上皮細胞大小及排列均正常，基底膜完整等。B組可見局部腎小管間質纖維化，并伴有明顯炎性細胞浸潤和腎小球系膜細胞增生，腎小管上皮細胞可見脫落和顆粒變性等。C組可見腎小管、小管間質區結構等基本正常，伴有部分腎小球系膜細胞輕度增生和、少量腎小管上皮細胞顆粒變性。D組可見局部腎小管間質輕度纖維化和炎性細胞浸潤，伴有腎小管水腫、細胞顆粒變性和腎小球萎縮等。各組大鼠腎組織病理特征由正常～病變嚴重順序依次為A、C、D、B組。見圖1。

3 討論

DN的發病機制目前尚不明確，早期進行有效診治可延緩病情的進展。血清Cys-c是半胱氨酸蛋白酶抑制劑，主要由機體所有有核細胞產生。循環中的Cys-c可經腎小球自由濾過，在近端腎小管上皮細胞被完全分解，腎臟是唯一清除Cys-c的器官，因此血清Cys-c是一種反映腎小球濾過率變化的理想同源性標志物[5]。研究表明血清Cys-c與腎小球濾過率（GFR）呈良好的線性關系，且早于、優于Cr，檢測血清Cys-c可明確DN的進展情況[6]。β2-MG由淋巴細胞等合成并分泌到血液及體液中，血液中的β2-MG可以從腎小球自由濾過，99.9%在近端腎小管吸收，并在腎小管上皮細胞中被分解[7-8]。當腎小球濾過功能下降時，血β2-MG開始升高，因而能夠及時反映腎小球濾過功能的損傷[7];當腎小管功能發生異常時，重吸收功能下降，尿β2-MG含量升高[9]，因而尿β2-MG是診斷腎小管功能損傷尤其是近曲小管功能損傷的敏感性指標。李波等[10]的臨床試驗結果顯示血清Cys-c、β2-MG比Cr、BUN能更敏感、更準確的反映GFR，對早期診斷腎功能損害具有重要臨床價值。

DN屬中醫“消渴”“水腫”“尿濁”等范疇，以氣陰兩虛為本，瘀血阻絡為標，病位在腎。患者消渴日久，化燥傷陰耗氣，終致氣陰兩虛;氣虛則氣血津液運行不暢，瘀血、痰濁阻絡[11]。根據DN氣陰兩虛、瘀血阻絡的基本病機，本研究采用中藥復方糖腎煎益氣養陰、活血通絡辨證治療，配方由黃芪、太子參、生地黃、山藥、山茱萸、茯苓、牡丹皮、三七、五味子等配伍而成，方中黃芪、太子參、山藥健脾益氣，使氣行血行。黃芪味甘性溫，可溫補肺、脾、腎，疏利三焦，可利水消腫[12]。生地黃清熱涼血，養陰生津，山茱萸補益肝腎，收斂固澀。現代藥理學[13]證實山地-山茱萸治療DN具有協同增益作用，可有效抑制DN患者糖基化產物產生，抑制細胞外基質（ECM）增生和轉化生長因子（TGF-β）表達，改善或延緩DN腎小球硬化。茯苓健脾滲濕、利水消腫;牡丹皮清熱涼血、活血化瘀;三七止血散瘀、補虛消腫;五味子益氣生津、補腎寧心。諸藥配伍共奏補益脾腎，益氣養陰、活血通絡之功[14-15]。

本研究顯示，B組大鼠的血糖、血清Cys-c、血、尿β2-M、24 h-UAlb均明顯升高，但腎功能尚正常，血清BUN、Cr升高并不顯著（P>0.05），符合早期氣陰兩虛型2型糖尿病腎病特點。C組和D組用藥治療20周后，大鼠血清Cys-c、血、尿β2-M、24 h-UAlb均較B組有明顯降低（P<0.05或P<0.01），且2組療效類似，證實了糖腎煎能改善2型糖尿病腎病的腎功能，對腎臟具有保護作用。但本研究也存在不足，未對糖腎煎保護2型DN大鼠腎功能的作用機制進行探究，有報道[16]指出糖克腎煎劑可能通過降低TGF-β1、mi R-192、Col1a2、Collagen I的表達，提高SIP1表達等途徑保護DN大鼠腎臟功能，在后續研究有待深入完善。

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（2019-06-13收稿 責任編輯：王楊）