紫檀芪對博來霉素誘導的肺纖維化大鼠上皮間質轉化的影響

彭艷芳 張瑩雯 張亞兵

摘要 目的：觀察紫檀芪（Pterostilbene，PTE）對博來霉素誘導的大鼠肺纖維化進程中上皮間質轉化（EMT）的抑制作用及其可能機制。方法：選取40只SD大鼠隨機分為4組，分別為正常組、模型組、紫檀芪組及潑尼松組。除正常組外，其余組采用氣管內注射博來霉素溶液制備大鼠肺纖維化模型。紫檀芪組給予30 mg/（kg·d）紫檀芪溶液灌胃，潑尼松組給予3 mg/（kg·d）潑尼松溶液灌胃，正常組和模型組予以等量DMSO溶劑灌胃，連續21 d。取肺組織行天狼猩紅染色觀察大鼠肺組織中Ⅰ型膠原（Collagen Ⅰ）、Ⅲ型膠原（Collagen Ⅲ）的分布情況;免疫組化和PCR檢測大鼠肺組織α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、上皮細胞鈣連蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）的表達。結果：與正常組比較，模型組Col-Ⅰ、Col-Ⅲ的分布均增多，Vimentin、α-SMA蛋白和mRNA的表達升高，E-cadherin蛋白和mRNA的表達下降。與模型組比較，藥物組Ⅰ、Ⅲ型膠原的分布均減少，同時上調E-cadherin的mRNA及蛋白表達水平，抑制α-SMA、Vimentin的mRNA及蛋白表達水平。結論：紫檀芪能有效緩解肺纖維化大鼠的纖維化進程，其機制可能與抑制膠原形成以及調控EMT相關分子的表達有關。

關鍵詞 紫檀芪;Ⅰ、Ⅲ型膠原;肺纖維化;上皮間質轉化;細胞外基質

Abstract Objective：To observe the inhibitory effects of Pterostilbene（PTE）on Epithelial-to-mesenchymal transition（EMT）in bleomycin-induced pulmonary fibrosis in rats and its possible mechanism.Methods：A total of 40 SD rats were randomly divided into 4 groups：a normal group，a model group，a PTE group and a prednisone group.Except for the normal group，the rat pulmonary fibrosis model was prepared by intratracheal injection of bleomycin solution.30 mg/（kg·d）of PTE was given to the PTE group，3 mg/（kg·d）of prednisone was given to the prednisone group，and the normal group and the model group were given the same amount of DMSO for 21 days.Take the lung tissue and stain it with Sirius scarlet to observe the distribution of collagen type Ⅰ（Collagen Ⅰ）and collagen type Ⅲ（Collagen Ⅲ）in rat lung tissue.Immunohistochemistry and PCR detected the expression of a-SMA，E-cadherin and Vimentin in rat lung.Results：Compared with normal group，the distribution of Col-Ⅰand Col-Ⅲ in the model group were increasing.Vimentin，a-SMA higher protein and mRNA expression were rising.The expression of E-cadherin protein and mRNA decreased.Compared with the model group，the distribution of type Ⅰ and type Ⅲ collagen in the drug group was reduced，and at the same time the mRNA of E-cadherin and protein expression levels were up-regulated，and the mRNA of α-SMA、Vimentin and protein expression level were inhibited.Conclusion：PTE can effectively alleviate the fibrosis process of pulmonary fibrosis rats.The mechanism may be related to the inhibition of collagen formation and the regulation of the expression of EMT-related molecules.

Keywords Pterostilbene; Type Ⅰ and Ⅲ collagen; Pulmonary fibrosis; Epithelial-mesenchymal transition; Extracellular matrix

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.18.004

肺纖維化（Pulmonary Fibrosis，PF）是由多種因素導致的慢性進行性間質性肺部疾病，病理表現以成纖維細胞增殖、大量細胞外基質（Extracellular matrix，ECM）增生并伴炎性損傷、膠原沉積、肺組織結構破壞及重構等為特征，臨床表現為活動性呼吸困難、限制性通氣功能障礙、低氧血癥等，最終發展為呼吸循環衰竭而死亡，嚴重危害人類身體健康[1]。吸煙、病毒感染、環境污染、遺傳易感性和藥物等為常見病因，隨著人口老齡化加劇，加上空氣污染日益嚴重，其患病率和發病率不斷上升，盡管近年來我們對PF發病機制的認識和治療有了一定的進展，但目前尚沒有特效藥物來治療肺纖維化。研究發現，在肺纖維化患者及博來霉素引起的鼠肺纖維化模型中均發現上皮細胞損傷后的修復過程中伴有上皮間質轉化（Epithelial-to-mesenchymal Transition，EMT），EMT是肺纖維化的關鍵過程。肺泡上皮細胞在炎性反應、氧化應激以及某些細胞因子等刺激下逐漸失去緊密連接，向間充質細胞轉變，成纖維細胞、肌成纖維細胞積累，細胞外基質分泌增多，則發生EMT[2]，是肌成纖維細胞的重要來源，在EMT的過程中有許多通路和細胞因子參與。EMT過程被啟動，產生大量的細胞外基質（ECM），從而分泌大分子的復雜網絡，例如膠原蛋白、酶等，維持器官發育，而ECM過度沉積或失調會出現病理修復，正常的肺組織結構反復破壞，進一步導致EMT持續發生，最終出現組織器官的纖維化[3]，因此EMT在肺纖維化形成中起關鍵作用。

隨著對PF研究的深入，中醫中藥表現出突出的的特點和優勢。肺纖維化患者需長期服藥，所以開發低毒、不良反應少、能夠長期服用的抗EMT藥物是肺纖維化藥物研發的方向。紫檀芪是中藥龍血竭的有效組成成分及存在于紫檀、葡萄、藍莓等植物的生物活性成分，具有預防氧化應激反應、抗腫瘤、抗炎、抗纖維化等作用，是白藜蘆醇的甲基化衍生物，且具有更高的生物利用度。Gu TT等[4]研究發現，紫檀芪可延緩果糖誘導的腎纖維化大鼠腎臟纖維化的進展，具有抗纖維化作用。本實驗室前期研究證實了紫檀芪明顯抑制博來霉素誘導的大鼠肺纖維化[5]，但其具體的作用機制目前尚不明確。目前肺纖維化的發病機制典型特征是ECM的過度沉積以及EMT，在EMT過程中有很多因子會發生改變，其中細胞外基質中主要成分Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原過度蓄積，間充質標志物如α-SMA、Vimentin等的表達水平上調，α-SMA是肺纖維化過程中肌成纖維細胞的表型標志，E-cadherin表達丟失是EMT最顯著的特征[6-7]。本實驗旨在研究紫檀芪對肺纖維化大鼠的影響及通過紫檀芪作用下EMT目的蛋白E-cadherin、ECM標志蛋白α-SMA、Vimentin、Col-I等的調節變化來推測紫檀芪在肺纖維化中的可能作用，意在為紫檀芪治療肺纖維化提供新思路。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選取健康雄性 SD大鼠40只，SPF級，體質量（200±20）g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司;動物許可證號SCXK（京）2016-0006。飼養于武漢大學醫學院動物房，適應性喂養1周。

1.1.2 藥物 紫檀芪（PET，上海哈靈生物科技有限公司），純度>99%，相對分子質量為256.30，分子式C16H16O3），常溫、避光保存，溶于DMSO中。對照藥物：潑尼松片（浙江仙居制藥股份有限公司，國藥準字H33021207），5 mg/片。

1.1.3 試劑與儀器 博來霉素（日本化藥株式會社，貨號：H20055883）;BSA（牛血清白蛋白）（Roche公司，型號：10735078001）;DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司，型號：ZLI-9033）;Vimentin一抗（Abcam公司，貨號：ab20346）;α-SMA一抗（博士德公司，貨號：BM0002）;E-Cadherin一抗（Servicebio公司，貨號：GB12082）;天狼猩紅染液（ASPEN公司，貨號：AS1067）;中性樹膠（國藥集團化學試劑有限公司，貨號：10004160）;TRIpure Total RNA Extraction Reagent（ELK Biotechnology公司，貨號：EP013）;PCR儀（杭州博日科技公司，型號：TC-XP）;熒光定量PCR儀（Life technologies公司，型號：StepOneTM Real-Time PCR System）;倒置顯微鏡（OLYMPUS公司，型號：IX51）;成像系統（Q-IMAGING公司，型號：MicroPublisher）;病理切片機（上海徠卡儀器有限公司，型號：RM2016）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將大鼠隨機分為正常組（A組）、模型組（B組）及潑尼松組（C組）、紫檀芪組（D組），每組10只，所有大鼠適應性喂養1周。除正常組外，其余3組大鼠參照Szapie等[8]經典造模方法誘導PF大鼠模型：大鼠麻醉后仰臥固定于鼠臺上，將鼠頸部皮膚消毒并逐層分離，用1 mL注射器經暴露的氣管朝向心端穿刺，注入博來霉素生理鹽水溶液0.2～0.3 mL誘導肺纖維化模型，注射完畢后立即將大鼠直立旋轉30 s，盡量使藥液向下流入肺內時能夠均勻分布，然后切口局部縫合。正常組以相同方法滴入等體積生理鹽水，待大鼠自然蘇醒后自由進食和飲水。

1.2.2 給藥方法 于造模后第2天開始進行灌胃給藥，空白組和模型組DMSO溶劑灌胃10 mL/（kg·d），潑尼松組予以潑尼松混懸液3.0 mg/（kg·d），紫檀芪組予以紫檀芪30 mg/（kg·d）給藥，連續3周。

1.2.3 天狼猩紅染色檢測大鼠肺組織膠原沉積 天狼猩紅是一種陰離子強酸性染料，可與膠原分子特異性結合而染色，能顯示組織中Ⅰ～Ⅳ型膠原，其染色是顯示肺纖維化時膠原含量變化的一種理想且特異的方法[9]。石蠟切片常規脫蠟至水，將水洗過的切片入天狼猩紅染液中浸染1 h，片子直接入純乙醇分化脫水，二甲苯Ⅰ5 min-二甲苯Ⅱ5 min中脫水透明，中性樹膠封片。

1.2.4 免疫組化檢測大鼠肺組織Vimentin、α-SMA、E-cadherin蛋白的表達 石蠟切片經二甲苯脫蠟、EDTA緩沖液中微波修復，置于3%過氧化氫溶液中，室溫下避光孵育10 min，PBS沖洗，5% BSA封閉20 min去除BSA液，每張切片滴加含鼠α-SMA抗體（1∶400）、鼠E-cadherin抗體（1∶100）、鼠Vimentin抗體（1∶100）的一抗，4 ℃搖床孵育過夜，PBS沖洗，滴加相應種屬的二抗（1∶200），37 ℃孵育50 min，PBS洗后加DAB溶液，顯微鏡控制顯色，蘇木素復染，脫水干燥，透明封固，使用顯微鏡拍照。

1.2.5 RT-PCR檢測大鼠肺組織Vimentin、α-SMA、E-cadherin mRNA的表達 取大鼠右上肺組織20 mg，于1 mL預冷的TRIpure中充分研磨勻漿，倒入EP管中加入250 μL三氯甲烷10 min離心，嚴格按照超純RNA提取試劑盒提取總RNA，配制qRT-PCR反應體系。見表1。第一鏈cDNA的合成采用EntiLinkTM1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒進行（ELK Biotechnology，EQ003），實時熒光定量PCR是在Life technologies公司的StepOneTM Real-Time PCR儀上完成，每個樣品均作3個復孔，使用EnTurboTM SYBR Green PCR SuperMix試劑盒進行（ELK Biotechnology，EQ001）采用2-△△Ct法計算 mRNA表達量。見表1。

1.3 統計學方法 采用SPSS 20.0統計軟件對研究數據進行統計分析，計量資料用均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 4組動物肺纖維化程度改變比較 膠原含量是確定肺纖維化是否發生及其嚴重程度的關鍵指標，天狼猩紅染色是膠原較特異性的染色方法，可以在1張切片上同時顯示出Ⅰ型和Ⅲ型膠原纖維及其相互間的關系。結果可見正常肺組織中除各級支氣管和血管壁存在較多Ⅰ和Ⅲ型膠原之外，肺泡壁僅有少量膠原存在。模型組肺泡壁可見較多黃色或紅色Ⅰ型膠原及綠色的Ⅲ型細纖維膠原沉積，Ⅰ型膠原纖維呈緊密排列，為黃色或紅色的纖維，Ⅲ型膠原纖維呈疏網狀，顯示弱的雙折光性，為綠色的細纖維，大鼠肺組織膠原的面積顯著高于正常組（P<0.01）;經紫檀芪干預治療后Ⅰ型與Ⅲ型膠原面積均較模型組下降（P<0.01）。見圖1，表2。

2.2 4組動物采用免疫組化法檢測Vimentin、α-SMA、E-cadherin蛋白表達的比較 α-SMA蛋白主要表達于氣管周圍，E-cadherin主要位于肺泡上皮，以棕黃色染色為陽性表達。與正常組比較，模型組肺泡周圍α-SMA、Vimentin表達明顯增加，肺組織E-cadherin表達明顯下調（P<0.01）;與模型組比較，紫檀芪組和潑尼松組E-cadherin表達增加，α-SMA、Vimentin表達減少，紫檀芪可抑制模型組誘導的肺組織EMT。見圖2，表3。

2.3 4組動物采用RT-PCR法檢測Vimentin、α-SMA、E-cadherin結果比較 與正常組比較，模型組Vimentin、α-SMA mRNA水平顯著增高，E-cadherin mRNA水平降低（P<0.01）;與模型組比較，紫檀芪處理組Vimentin、α-SMA mRNA水平顯著降低，E-cadherin mRNA水平增高，差異有統計學意義（P<0.01）;但紫檀芪組和潑尼松組比較，差異無統計學意義（P>0.05），提示紫檀芪可以下調肺纖維化大鼠的Vimentin、α-SMA mRNA表達，上調E-cadherin mRNA表達。見圖3。

3 討論

目前中醫文獻中多把肺纖維化歸類為肺痿、肺痹范疇，病機為正氣虧虛，痰瘀阻絡的虛實夾雜。《金匱要略·心典》曰：“蓋肺為嬌臟，熱則氣爍，故不用而痿;冷則氣沮，故亦不用而痿也”。紫檀芪為中藥龍血竭的有效組成成分，龍血竭有“活血之圣藥”美譽（明·李時珍《本草綱目》卷34），具有活血、化瘀、止血、補血的功效。Nichols等[10]評估劍龍血竭中有效成分發現為紫檀芪>白藜蘆醇>龍血素B>龍血素A。現代研究提示龍血竭和白藜蘆醇等[11-12]可減緩肺纖維化進展，減輕PF大鼠肺組織纖維化程度。肺纖維化是以彌漫性肺間質改變為主要特征的肺疾病，其主要病理變化為成纖維細胞增殖分化和細胞外基質產生增多。紫檀芪是一種有效的抗炎抗氧化應激的天然藥物，本炎性反應采用博來霉素誘導大鼠制備肺纖維化模型，從上皮間質標志蛋白α-SMA、Vimentin、E-cadherin蛋白和mRNA表達以及Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達等影響入手，探討紫檀芪抗肺纖維化作用于EMT的效應機制。

肺纖維化是多種原因引起慢性肺疾病的共同結局，肺纖維化的發病—般認為要經歷損傷、炎性反應變化、生理修復3個階段，首先是肺組織細胞受到內在或外界的生物、化學、物理等不同方面的刺激，對肺臟組織逐漸造成傷害;其次受到傷害的肺組織細胞會產生自我防御措施，促使正常細胞的表型發生轉變，形成具有收縮功能的肌成纖維細胞，同時促進EMT的發生，使上皮細胞失去基底膜的連接支撐而遷移和侵入，成為間充質干細胞，分泌產生EMC，促進好轉或纖維化，同時相關炎性反應信號通路被激活，引起創傷部位炎性反應;通過免疫應答系統激活T淋巴細胞，增加膠原蛋白的分泌而起到修復受損肺組織的作用;最后由于有害因素的反復刺激，EMC的破壞與修復反復進行，導致EMT不斷發生，炎性因子不斷表達分泌，最終導致成纖維細胞過度增殖和EMC蛋白代謝異常和膠原纖維的過度沉積，出現肺纖維化[13]。肌成纖維細胞可產生大量ECM，如α-SMA，Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白等，導致細胞重塑，從而放大纖維化的級聯反應[14]。膠原在肺組織中含量豐富，是ECM的一種結構蛋白質，其代謝失衡是ECM過度沉積的主要標志，其中起主要作用的是Ⅰ型和Ⅲ型膠原，主要存在于各級支氣管壁和血管壁。在致纖維化因素的作用下，Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原合成代謝超過分解代謝，過多的膠原纖維在肺組織中不斷沉積，導致ECM的過度積累和進行性纖維化形成，這是肺纖維化形成過程中最重要的病理改變，因此膠原含量變化是判斷肺纖維化程度的一個特征性指標[15]。而在本次研究中天狼猩紅染色法顯示肺中模型組Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白增多，說明在肺纖維化過程中膠原纖維大量積聚，而在用藥組中其表達均有所下降，紫檀芪對膠原沉積的抑制作用與潑尼松組比較無差異，紫檀芪抑制Ⅰ、Ⅲ型膠原為代表的ECM合成，推測其抗纖維化作用與延緩上皮細胞的轉換有關。

在EMT過程中[16]，上皮細胞標記物如緊密連接蛋白-1和E-cadherin表達的減少，E-cadherin基因被抑制，E-cadherin生成減少使黏附連接點的不穩定性增加;間充質細胞標記物如α-SMA、E-cadherin、Vimentin、膠原蛋白和纖維連接蛋白的表達增加，形成了“鈣粘蛋白轉換”，與上皮細胞的聯系減弱，肌動蛋白應力纖維形成;Vimentin基因得到活化，影響了E-cadherin與細胞膜之間的聯系，使中間纖維成分發生變化。E-cadherin是一種鈣依賴性黏附分子，在正常情況下將肺泡上皮細胞緊密地黏附在一起，參與調節上皮形成并維持它的完整過程，此外E-cadherin與Vimentin的表達與EMT具有緊密聯系，對組織結構的形成與維持起著非常重要的作用[17]。肌成纖維細胞（Myofibroblast，MFB）具有細胞增殖及合成ECM的功能，能導致組織器官由修復向纖維化轉變，是器官纖維化發展過程中最重要的效應細胞，而α-SMA是肺纖維化過程中肌成纖維細胞的特異性標志物，其表達對于肌成纖維細胞代謝和形態學特性維持起重要作用，增多可明顯增強肌成纖維細胞的遷移及收縮能力，進而增強ECM的合成和分泌，表達量和肺纖維化程度成正相關，標志EMT的發生，與肺纖維化患者存活率呈負相關[18]。Nagaraja SS等[19-20]研究表明，E-cadherin為上皮細胞標志物，過量表達的α-SMA能抑制E-cadherin的表達，使上皮細胞黏附力減弱，相鄰細胞間連接變得疏松而出現遷徙增強，ColⅠ、α-SMA的表達量開始逐漸上升，ECM大量沉積，發生EMT過程，進而導致纖維化的發生。本研究結果提示紫檀芪可能通過抑制EMT，使E-cadherin表達上調，減少α-SMA、Vimentin蛋白及mRNA表達，增加細胞黏附力，降低細胞侵襲能力，降低膠原蛋白的沉積，從而抑制肺泡壁增厚和肺泡損傷。

綜上所述，紫檀芪可以顯著抑制肺組織膠原蛋白的合成與沉積，降低大鼠纖維化肺組織中的α-SMA、Vimentin的表達能力，增加E-cadherin表達水平，有效的改善免疫平衡，降低ECM的合成，調控EMT過程而發揮抗肺纖維作用。

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（2020-07-20收稿 責任編輯：王楊）