基于網絡藥理學探討加味過敏煎治療蕁麻疹的作用機制

任雪雯 李元文 胡博

摘要 目的：通過網絡藥理學方法探討加味過敏煎治療蕁麻疹的作用機制。方法：檢索中藥系統藥理學平臺（TCMSP）選取加味過敏煎君藥中的有效元素和作用靶點;通過檢索人類基因信息數據庫選取蕁麻疹的疾病靶點;應用R語言篩選藥物與疾病共同靶點，應用Cytoscape軟件構建藥物-化合物-作用靶點-疾病互作網絡;運用STRING平臺構建蛋白質間相互作用網絡（PPI），并將結果進行可視化展示;使用Bioconductor生物信息軟件包進行GO功能富集分析和KEGG通路分析。結果：包含了45個化合物和相應靶點409個，并得到61個疾病相關作用靶點。富集分析得到84個GO功能條目和126條KEGG信號通路。結論：加味過敏煎作用于蕁麻疹的PPI網絡中IL-6、AKT1、VEGFA等靶點起著關鍵作用，這些靶點主要涉及細胞因子受體結合、細胞因子及受體配體活性等生物學過程，并主要富集在AGE-RAGE、PI3K/Akt等多條信號通路上，發揮抗炎和免疫調節等作用，這可能是加味過敏煎治療蕁麻疹的關鍵作用機制。

關鍵詞 網絡藥理學;加味過敏煎;蕁麻疹;靶點;信號通路

Abstract Objective：To explore the mechanism of modified allergic Decoction in the treatment of urticaria based on network pharmacology theory. Methods：Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform（TCMSP） was used to select the effective constituents and action targets of Jiawei allergic Decoction. Human gene information database was used to select the disease targets of urticaria. R language software was used to screen the common targets of drugs and diseases， Cytoscape software was used to build drug-ingredient-action target-disease interaction network. Protein protein interaction network（PPI） was constructed by using the STRING platform， and the results were visualized. Bioconductor bioinformatics software package was used to perform Gene Ontology （GO） function enrichment and Kyoto pathway analysis. Results：A total of 45 compounds and 409 corresponding targets were included， and 61 disease-related targets were obtained. Enrichment analysis yielded 84 GO function entries and 126 KEGG signal pathways. Conclusion：Jiawei allergic Decoction plays a key role in IL-6， AKT1， VEGFA and other targets in the PPI network of urticaria. These targets mainly involve the biological processes of cytokine receptor binding， cytokine and receptor ligand activity， etc. It is mainly enriched in multiple signal pathways such as AGE-RAGE， PI3K/Akt， and exerts anti-inflammatory and immunomodulatory effects. This may be the key mechanism of Jiawei allergic Decoction in the treatment of urticaria.

Keywords Network pharmacology; Jawei allergic Decoction; Urticaria; Targets; Signaling pathway

中圖分類號：R285文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.18.002

蕁麻疹是由肥大細胞介導的一種局限性的水腫反應，具體病理表現為皮膚、黏膜小血管擴張及滲透性增加。臨床表現可見基本皮損為鮮紅色或蒼白色風團，大小不等，發無定處，能相互融合，一般24 h內即可消褪，消褪后不留痕跡，急性蕁麻疹病程短，超過6周則為慢性蕁麻疹，且反復發作，甚者可長達數十年。急性蕁麻疹具有較為明確的病因，如食物、藥物或病毒感染等。而慢性蕁麻疹的病因往往難以確定，目前認為慢性蕁麻疹的發病與肥大細胞脫顆粒釋放組胺、炎性反應遞質白三烯等，進而引發后續的炎性反應、Th1/Th2細胞亞群失衡等有關[1]。據調查，高達20%的人在其一生中會出現急性蕁麻疹[2]，而慢性蕁麻疹的患病率約為0.05%～3%[2]。大概50%的慢性蕁麻疹患者在1年內自行消退，80%會在5年內消退[3]。西醫治療以抗組胺藥為首選，糖皮質激素輔助控制癥狀[4]，雖然有一定療效，但不適用于兒童、老人、孕婦等特殊人群，并且應用抗組胺藥導致的嗜睡及應用糖皮質激素后的不良反應嚴重影響了患者的正常工作。因此，深入研究蕁麻疹發病的可能機制并尋找更為安全有效的干預手段對于治療蕁麻疹具有重大意義。

近年，中醫藥作為一種較為安全有效的治療手段，在蕁麻疹中的治療作用中得到廣泛認可。李元文教授嘗試從調理肝脾功能入手治療蕁麻疹，并擬出加味過敏煎，以疏肝健脾，養血熄風為大法，標本兼治，在臨床應用中療效顯著[5-6]。加味過敏煎是從祝湛予先生的經驗方——過敏煎（銀柴胡、烏梅、防風、五味子、甘草）加減化裁而來，原方祛風清熱，斂汗固表，主要用于治療過敏性疾病。李元文教授在此方的基礎上，加入了疏肝理脾，養血通絡之品，使加味過敏煎成為以疏肝健脾，養血熄風功效為主的治療慢性蕁麻疹的良方。具體方藥為柴胡10 g、烏梅10 g、防風10 g、白術10 g、茯苓20 g、當歸10 g、赤芍10 g、徐長卿15 g、絲瓜絡10 g、雞血藤15 g。方中柴胡、烏梅疏肝斂陰，白術、茯苓健脾化濕，共為君藥，是調和肝脾治療蕁麻疹思想的核心體現。前期團隊研究結果證實了，加味過敏煎對慢性蕁麻疹的治療有明顯療效[5-6]，但是作為其起效的確切效應有待進一步明確。網絡藥理學的研究方法是通過構建疾病-表型-靶蛋白-藥物的互作關系網絡，并通過GO和KEGG富集分析實現預測藥物有效成分在疾病效應靶點中的可能作用機制[7]，在近幾年作為研究中醫藥干預疾病機制的方法得到了廣泛應用。因此筆者選取加味過敏煎的君藥，也是疏肝健脾法的核心藥對——“柴胡-烏梅”和“茯苓-白術”進行網絡藥理學研究，以期在分子層面上能夠初步揭示加味過敏煎中運用疏肝健脾法治療蕁麻疹的可能作用機制，為本病的實驗研究及臨床實踐提供更多的思路。

1 材料與方法

1.1 加味過敏煎君藥的主要活性化合物的篩選及作用靶點的確定 本研究通過中藥系統藥理學分析平臺——TCMSP數據庫（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）[8]檢索加味過敏煎君藥藥對“柴胡-烏梅”“茯苓-白術”的所有活性成分。根據文獻方法[9-11]，通過設定口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%和類藥性（Drug-likeness，DL）≥0.18為限制條件篩選化合物，得到加味過敏煎君藥藥對的生物活性成分。并運用TCMSP數據庫查詢出主要生物活性成分的作用靶點，并利用Uniprot[12]數據庫（https：//uniprot.org/）得到活性化合物對應關鍵靶點的基因號及標準化命名。

1.2 蕁麻疹的疾病靶點收集 依托人類基因信息數據庫GeneCards（https：//www.genecards.org/）和人類孟德爾遺傳研究平臺OMIM（https：//www.omim.org/）進行檢索關鍵詞“urticaria”，進而得到蕁麻疹的最終疾病靶點。

1.3 藥物與疾病共同靶點篩選及互作網絡構建 將加味過敏煎中的君藥藥物靶點合并后，輸入疾病靶點，走腳本繪制Venn圖，從而得到藥物與疾病共同作用靶點交集;將得到的共同作用靶點通過STRING平臺（https：//string-db.org/）[13]構建靶標蛋白互作PPI網絡，并可視化處理。

1.4 藥物-化合物-作用靶點-疾病作用網絡圖搭建通過運行Cytoscape 3.7.2軟件（http：//www.cytoscape.org/）搭建藥物-活性化合物-作用靶點-疾病作用網絡。網絡圖中的節點分別代表了藥物、活性成分、基因靶點和疾病，連線代表上述節點之間的相互聯系[14]，更好地體現出藥物中的活性成分作用于基因靶點上治療疾病的概念。

1.5 GO分析和KEGG通路富集分析 將核心靶點基因進行功能富集和主要作用通路分析，使用Bioconductor生物信息軟件包（http：//www.bioconductor.org/）進行GO功能富集（Gene Ontology）[15]和KEGG通路富集（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）[16]分析，并對富集分析得出的結果進行可視化處理。

2 結果

2.1 加味過敏煎君藥的主要活性化合物及作用靶點

本研究通過TCMSP數據庫，檢索加味過敏煎中的君藥活性成分，共收集得478個活性成分，其中柴胡有349個，烏梅有40個，茯苓有34個，白術有55個。以OB≥30%和DL≥0.18為限制條件，經篩重后共得到45個有效生物活性成分。利用數據庫查詢主要活性成分調控的靶點信息，共篩選出對應的作用靶點409個。最后通過Uniprot數據庫對靶點和基因信息進行標準化命名。

2.2 蕁麻疹的疾病靶點篩選

分別在GeneCards、OMIM數據庫中檢索到977個、3個蕁麻疹的潛在靶點，去重后，共得到978個蕁麻疹相關疾病靶點。

2.3 共同靶點篩選及互作網絡構建

繪制Veen圖。見圖1。并得到藥物主要活性成分調控的靶點與疾病靶點取交集，得到61個共同作用靶點。見表1。將這61個基因在STRING平臺進行PPI網絡分析，并可視化處理。見圖2。得到61個節點和727條邊，每個節點代表由單個蛋白質編碼基因產生的所有蛋白質，每條邊代表蛋白質與蛋白質的結合，即蛋白質的協同作用。統計出現較多的30個節點并繪制出圖形。見圖3。可以發現蛋白互作頻次較高的是RAC-α絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（AKT1）、血管內皮生長因子（VEGFA）、白細胞介素-6（IL6）等，他們是整個網絡的節點蛋白，說明加味過敏煎疏肝健脾的中藥成分與其有較高的結合活性，可作為加味過敏煎治療蕁麻疹的潛在靶點。研究表明，慢性蕁麻疹患者血清IL-4、IL-6、IL-8、IL-10及IFN-γ水平異常[17]，在一定程度上支持了本項研究的結果。

2.4 藥物-化合物-作用靶點-疾病網絡

分別搭建出4味藥物-化合物-作用靶點-疾病網絡圖。見圖4。網絡共77個節點（靶點61個，活性成分11個，疾病1個和藥物4個）和200條線條，紅色節點代表蕁麻疹疾病，淺藍色節點分別代表加味過敏煎4味君藥，墨綠色節點代表加味過敏煎君藥對應的主要活性成分，橙色節點代表基因靶點，每條線表示活性成分和基因靶點之間的相互作用關系。結果顯示，槲皮素、山柰酚、豆甾醇、β-谷甾醇、常春藤皂苷元、乙酸亞油酸酯、花生四烯酸甲酯等化合物在整個網絡中發揮著關鍵作用，可能是加味過敏煎治療蕁麻疹的核心化合物。

2.5 靶點通路分析

通過Bioconductor數據庫進行GO功能分析，得到84個生物過程條目，將排名靠前的20個GO條目繪制柱狀圖。見圖5a。可以發現，在細胞因子受體結合（Cytokine Receptor Binding）、細胞因子活性（Cytokine Activity）、受體配體活性（Receptor Ligand Activity）等生物過程中，靶點較集中。這提示加味過敏煎中疏肝健脾的活性化合物通過調控多種生物學途徑對蕁麻疹產生影響。

KEGG通路富集分析篩選出126條信號通路，選取P值最小的20條通路繪制柱狀圖。見5b。可以發現這些基因數目主要富集在糖尿病并發癥AGE-RAGE信號通路、PI3K-Akt信號通路，等通路上。見圖6。

3 討論

本研究通過網絡藥理學方法構建加味過敏煎君藥的“藥物-活性成分-靶點-疾病”網絡，共得到45個活性化合物，61個潛在靶點，126條信號通路。在活性化合物中，槲皮素和山柰酚綜合評分遠高于其他化合物，均存在于在柴胡、烏梅中。研究發現二氫槲皮素具有抗炎、抗過敏、止癢作用，可能是與其可以阻滯肥大細胞的Ca2+通道，通過減少Ca2+的內流而抑制肥大細胞釋放組胺，從而降低毛細血管通透性，起到抗過敏止癢的效果[18]。山柰酚可調節信號傳導與轉錄激活因子3（STAT3）和NF-κB信號通路的激活，以減弱IL-6對環氧合酶COX-2（PTGS2）表達的影響[19]，抑制處于致敏狀態的肥大細胞的炎性反應，其對調節急性和慢性炎性反應起關鍵作用。豆甾醇能降低炎性反應因子IL-1β、IL-6、MCP-1和COX-2的mRNA表達，起到抗炎及免疫調節的作用[20]。β-谷甾醇、常春藤皂苷元亦具有抗菌抗炎等方面作用[20-21]。

將加味過敏煎主要活性成分調控的靶點與蕁麻疹的靶點取交集，得到61個關鍵靶點，大致分為細胞因子、蛋白激酶和其他蛋白酶3類。其中細胞因子占絕大部分，有IL-6、IL-1B、IL-10、IL-2、VEGFA、EGF、CXCL8、CCL2、IFNG、TNF、ICAM1、VCAM1、STAT1、CD40LG等。蛋白激酶有AKT1、ERBB2等。其他如PTGS2、HMOX1、caspase-3、CRP等。IL-6被證明是一種內源性熱原，能夠在自身免疫性疾病或感染患者中引起發熱。這種蛋白質主要在急性和慢性炎性反應部位產生，在該部位分泌到血清中，并通過IL-6Rα誘導轉錄炎性反應。研究表明，在慢性自發性蕁麻疹患者中，IL-6、sIL-6R和血清CRP的濃度顯著升高[22]。IL-6可以以STAT3依賴性方式增強FcεRI誘導的COX-2表達、PGD2生物合成和VEGF的產生，并通過促進組織內肥大細胞產生炎性PGD2而參與人類過敏性疾病[23]。IL-6還可以通過抑制sIL-6R從IL-6R的蛋白水解切割并下調SOCS3自抑制途徑，從而促進肥大細胞（MC）增殖并形成更具反應性的表型[24]。蕁麻疹發生的中心環節是肥大細胞活化脫顆粒，故而猜測加味過敏煎可能通過抑制IL-6水平表達，改善蕁麻疹患者的MC相關癥狀和病理，進而治療患者的癥狀體征。VEGFA基因是PDGF/VEGF生長因子家族的成員，可以調節細胞的增殖和凋亡，還可以誘導血管通透性，對于生理和病理性血管生成都是必不可少的[25]。有研究表明，VEGFA誘導血管內皮細胞的增殖或存活主要是通過ERK、PI3K/Akt通路形成的，這些通路的激活受這些信號蛋白調控[26]。其中AKT激活可以調控內皮細胞的存活、增殖、增加血管通透性，同時也表現出一定的炎性內皮細胞的特點[27]。同時研究表明，AKT1基因的缺失可以導致血管內皮生長因子誘導的血管生成，從而增加傷口、炎性反應和血管通透性[28]。蕁麻疹是由于血管通透性的短暫增加，而引起皮膚或黏膜的急性腫脹，從而發生時隱時現的紅白風團。這61個關鍵靶點，大多涉及炎性反應、免疫調節和血管通透性方面，推測可能是加味過敏煎中疏肝健脾法治療蕁麻疹的關鍵作用。

富集分析共得到84個GO功能條目和126條KEGG通路。其中，GO功能分析主要涉及炎性反應、氧化與抗氧化活性、免疫應答、細胞增殖和凋亡等作用，并且在炎性反應因子中體現了高度的結合活性，可作為中藥治療蕁麻疹的關鍵作用。KEGG通路富集分析顯示，在靶點富集的前20條通路中，基因數目主要富集在糖尿病并發癥PI3K/Akt信號通路、AGE-RAGE信號通路和TNF信號通路等通路上。其中在PI3K/Akt信號通路中，當酪氨酸激酶（RTK）和G蛋白連接受體結合，激活下游具有磷酸化酪氨酸殘基的生長因子受體連接蛋白從而激活PI3K，并激活底物磷脂酰肌醇二磷酸（PIP2）向磷脂酰肌醇三磷酸（PIP3）轉化。PIP3結合Akt以及磷酸肌醇依賴激酶1（PDK1）后，Akt構象變化，同時Akt遷至細胞膜，磷酸化膜上的PDK21和PDK2蛋白，進一步活化Akt[29]，促進激活下游蛋白，如核轉錄因子-κB（NF-κB）、叉頭轉錄因子（FoxO）等，通過復雜的信號傳遞網絡，PI3K/Akt信號通路參與免疫調控[30]、介導細胞因子表達[31]、調節凋亡[32]。

蕁麻疹在中醫又稱“癮疹”“風疙瘩”“赤白游風”等。現今社會，隨著生活節奏的加快，普遍存在工作、學習壓力大的情況，再加上飲食不規律，嗜食肥甘厚味，極易損及肝、脾。古人對肝脾失調導致蕁麻疹也有所闡述，如“癮疹……有人一生不可食雞肉及章魚動風之物，才食則丹隨發，以此得見系是脾風”[33];“以飲食久膊、膏粱厚味、醇酒辛辣之物，日久太過……其風塊多出于胸部、或見于四肢”[34];另肝失疏泄也可引發蕁麻疹，如《外科樞要》言：“赤白游風屬……或肝火風熱、血熱”。蓋情志不遂，郁怒傷肝，肝逆克脾土。肝失調達而橫乘脾土，加之飲食、勞倦傷脾，脾失健運而反侮于肝;又因肝藏血，脾統血，肝失疏泄，運化血，脾虛化源不足，導致血虛生內風，或脾濕日久郁而化熱，熱灼肝經，傷津耗液，熱極生風，發于肌表而見皮疹。現代醫家對于中醫之肝、脾的功能、生理特點的表述，與現代醫學臟器功能認識大多一致。肝臟具有解毒、造血和凝血作用，脾臟內的大量巨噬細胞可以清除衰老的血細胞、抗原和異物、激發免疫反應。肝氣郁滯，其解毒功能受損;脾氣虛弱，其免疫反應失調。因此，李元文教授在此基礎上提出：蕁麻疹的發病與肝脾功能失調有密切的關系[35]。李教授認為蕁麻疹的發病與外毒侵襲密不可分，生活中的過敏原或毒性物質，如重金屬、藥物、食物添加劑、食物里面的某些成分，經過口服、呼吸道和皮膚吸收進入人體，其中部分小分子無法像病毒細菌那樣引起免疫反應，便可以依靠肝臟的解毒功能來治療。結合本研究網絡藥理學結果，加味過敏煎中疏肝健脾法治療蕁麻疹的作用可能與其活性化合物發揮抗炎、免疫調節等機制相關。

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（2020-04-15收稿 責任編輯：徐穎）