ATP生物熒光增幅法在微生物檢測中的可行性研究─應(yīng)用于化妝品領(lǐng)域

翟磊，葛媛媛，洪海軍，劉吉泉，李婷，沈穎，林雅芳，蔡俊松，劉驥，劉瑞娜，王旭，姚粟*

1(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京，100015)2(聯(lián)合利華(中國)有限公司，上海，200335) 3 (Procter & Gamble International Operations，新加坡，138547) 4(北京寶潔技術(shù)有限公司，北京，101312)5(查士利華微生物應(yīng)用技術(shù)(上海)有限公司，上海，201708)

近年來，我國化妝品質(zhì)量顯著提升，據(jù)不完全統(tǒng)計，2015年至今我國化妝品市場抽檢合格率平均達(dá)到95%以上，但不合格產(chǎn)品中的微生物污染問題仍然存在并被社會重點關(guān)注[1-4]。《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》[5](2015年版)(以下簡稱《規(guī)范》)將菌落總數(shù)、霉菌和酵母菌納入常規(guī)檢驗項目，檢測方法為平板計數(shù)法，該方法檢驗周期較長、使用人工計數(shù)，效率較低，目前已無法完全適應(yīng)化妝品行業(yè)產(chǎn)能擴(kuò)大、流通加速的迅猛發(fā)展需求[6]。當(dāng)前微生物快速檢驗新興技術(shù)不斷涌現(xiàn)[7-10]，新方法開發(fā)、驗證、適用性評價及標(biāo)準(zhǔn)化應(yīng)用成為微生物安全控制領(lǐng)域的研究熱點并取得顯著進(jìn)展[11-14]。各國藥典和國際組織陸續(xù)頒布并不斷完善替代方法驗證相關(guān)指南。借鑒國內(nèi)外食品和制藥等微生物檢驗領(lǐng)域的成功運用經(jīng)驗，對我國化妝品微生物檢驗方法開展系統(tǒng)性研究[15]，將有力推動化妝品微生物檢測效率和過程控制水平提升，并在保障產(chǎn)品安全和消費者權(quán)益方面發(fā)揮重要作用。

本課題組前期基于ATP生物熒光技術(shù)[16-19]建立了一套適用于微生物快速檢測的ATP生物熒光增幅法，具有檢測速度快，準(zhǔn)確度高的特點，可在48 h內(nèi)實現(xiàn)樣品中細(xì)菌、霉菌和酵母菌的定性檢驗。該方法利用微生物體內(nèi)的腺苷酸激酶AK，催化添加的二磷酸腺苷ADP轉(zhuǎn)換為三磷酸腺苷ATP，短時間內(nèi)實現(xiàn)ATP增幅；通過添加熒光素酶和熒光素，將ATP高能鍵在斷裂過程中產(chǎn)生的能量轉(zhuǎn)化為生物熒光信號，通過計算生物熒光信號強度判斷樣品中是否含有微生物。為評價ATP生物熒光增幅法在化妝品微生物檢測中應(yīng)用的可行性，本研究收集了與化妝品原料及其生產(chǎn)環(huán)境相關(guān)的47株代表性菌株，進(jìn)行了富集培養(yǎng)基MTAT的促生長能力測試；選取了清潔類、護(hù)理類、美容修飾類6種化妝品，通過樣品影響測試和接菌試驗來評價化妝品產(chǎn)品的適用性，探究ATP生物熒光增幅法在化妝品及相關(guān)領(lǐng)域開展微生物快速篩選與檢測的應(yīng)用前景。

1 儀器與材料

1.1 試驗儀器

Celsis?Ad ance II 光度計，Charles Ri er Laboratories；恒溫振蕩搖床THZ-98AB，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；往復(fù)式搖床，EBERBACH；恒溫培養(yǎng)箱GHP-9270，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；生物安全柜AC2-4S1，ESCO。

1.2 試驗菌株

通過文獻(xiàn)調(diào)研，結(jié)合微生物分類學(xué)特征和生長特性，本研究收集了與化妝品原料及其生產(chǎn)環(huán)境相關(guān)的47種細(xì)菌、霉菌和酵母菌代表菌株，用于促生長能力測試和產(chǎn)品適用性試驗，具體菌株信息見表1。

1.3 試驗樣品

根據(jù)化妝品分類標(biāo)準(zhǔn)[20]，選取了清潔類、護(hù)理類、美容修飾類6種化妝品，包括洗發(fā)水、沐浴液、護(hù)發(fā)素、定型水、面霜和面膜，每種產(chǎn)品選取3個不同生產(chǎn)批次。

1.4 試驗試劑

改良TAT(MTAT)培養(yǎng)基：TAT肉湯 22.50 g/L，硫代硫酸鈉 0.50 g/L、組氨酸 0.10 g/L、蛋白胨 7.50 g/L、葡萄糖 15.00 g/L、氯化鈉 0.85 g/L、卵磷脂1.43 g/L和吐溫80 39.00 g/L，pH 值調(diào)至7.0±0.1；ATP生物熒光增幅法試劑，Charles Ri er Laboratories Celsis?AMPiScreenTM；消泡劑，J.T.Baker?Antifoam B?Silicone Emulsion；0.5 mm玻璃珠，BioSpec Product。

2 實驗方法

2.1 促生長能力測試

將試驗收集的細(xì)菌和酵母菌制備成10～100 CFU/10 mL的菌懸液，霉菌制備10～100 CFU/10 mL的孢子懸液，接種到90 mL富集培養(yǎng)基MTAT，置于(30±2) ℃搖床，200 r/min，振蕩培養(yǎng)24～48 h。在24或48 h取樣，使用ATP生物熒光增幅法對富集培養(yǎng)物進(jìn)行上機檢測，若樣品為霉菌，則需使用玻璃珠破壁處理30 min后再上機檢測。同時，將細(xì)菌富集培養(yǎng)物接種于卵磷脂吐溫80-營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，置于(36±1) ℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)(48±2) h；酵母菌和霉菌富集培養(yǎng)物接種于虎紅培養(yǎng)基，置于(28±2) ℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)5 d，確認(rèn)接種物是否有微生物生長。

表1 促生長能力測試結(jié)果Table 1 Growth promotion test results

促生長能力測試通過的標(biāo)準(zhǔn)為，試驗收集的47株微生物菌株均能在富集培養(yǎng)基MTAT中生長良好，且ATP生物熒光增幅法檢測結(jié)果均為陽性。若促生長能力測試不能通過上述標(biāo)準(zhǔn)，需要對富集培養(yǎng)基的配方和培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。

2.2 產(chǎn)品適用性試驗

產(chǎn)品適用性試驗包括樣品影響測試和接菌試驗。化妝品產(chǎn)品在應(yīng)用ATP生物熒光增幅法檢測前，應(yīng)先進(jìn)行產(chǎn)品適用性試驗來確定ATP生物熒光增幅法是否適用于待檢產(chǎn)品。本研究選擇大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)CICC 10389、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)CICC 10419、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)CICC 10384、枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)CICC 10275、白色念珠菌(Candidaalbicans)CICC 1965和黑曲霉(Aspergillusniger)CICC 2487用于產(chǎn)品適用性試驗研究。

2.2.1 樣品影響測試

樣品影響測試的目的是確保化妝品中的配方成分不會影響ATP生物熒光增幅法檢測，每種產(chǎn)品檢測3個不同生產(chǎn)批次。操作步驟為：將10～100 CFU試驗菌株接種于10 mL富集培養(yǎng)基MTAT中制備菌懸液 (黑曲霉制備孢子懸液)，同時將等量的菌液涂布于卵磷脂吐溫-80營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或虎紅培養(yǎng)基上確認(rèn)實際接種量。稱取10 g產(chǎn)品，加至90 mL富集培養(yǎng)基MTAT中，充分振蕩混勻，取10 mL 1∶10稀釋液加到90 mL富集培養(yǎng)基MTAT制備成產(chǎn)品樣品，同時將不接菌的富集培養(yǎng)基MTAT作為培養(yǎng)基空白。將上述制備的菌懸液、產(chǎn)品樣品和培養(yǎng)基空白置于(30±2) ℃搖床，200 r/min，振蕩培養(yǎng)48 h。取樣，對富集培養(yǎng)后的產(chǎn)品樣品進(jìn)行上機檢測，并使用平板培養(yǎng)方法確認(rèn)產(chǎn)品中是否含有微生物；取900 μL培養(yǎng)基加入100 μL ATP標(biāo)品，制備成ATP對照；取900 μL培養(yǎng)基空白加入100 μL富集培養(yǎng)物的100倍稀釋液，制備成微生物對照；取900 μL產(chǎn)品樣品加入100 μL ATP陽性對照標(biāo)品，制備為ATP樣品；取900 μL產(chǎn)品樣品加入100 μL富集培養(yǎng)物的100倍稀釋液，制備成微生物樣品。將上述制備的樣品和對照進(jìn)行ATP生物熒光增幅法檢測，同時取100 μL涂布于卵磷脂吐溫80-營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或虎紅培養(yǎng)基上確認(rèn)相應(yīng)樣品中是否含有微生物。樣品影響測試結(jié)果的通過標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 樣品影響測試通過標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Success criteria for sample effect tests

2.2.2 接菌試驗

接菌試驗主要用于確認(rèn)加入樣品中的防腐劑能否被富集培養(yǎng)基有效中和，每種產(chǎn)品檢測3個不同生產(chǎn)批次。操作步驟為：稱取10 g產(chǎn)品，加入90 mL富集培養(yǎng)基MTAT，充分振蕩混勻，取10 mL 1∶10稀釋液加到90 mL富集培養(yǎng)基MTAT制備成產(chǎn)品樣品，同時將不接菌的富集培養(yǎng)基MTAT作為培養(yǎng)基空白。將試驗菌株制備成10～100 CFU/100 μL的菌懸液(黑曲霉制備孢子懸液)備用，同時取100 μL涂布于卵磷脂吐溫80-營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或虎紅培養(yǎng)基上以確認(rèn)實際接種量。接種100 μL菌懸液或孢子懸液于產(chǎn)品樣品中制備成微生物樣品，同時接種100 μL菌懸液或孢子懸液于培養(yǎng)基空白中制備成微生物對照；將制備的產(chǎn)品樣品、培養(yǎng)基空白、微生物樣品和微生物對照置于(30±2) ℃搖床，200 r/min振蕩培養(yǎng)48 h。對富集培養(yǎng)后的樣品進(jìn)行ATP生物熒光增幅法檢測，若樣品為霉菌，則需使用玻璃珠破壁處理30 min后再上機檢測。同時取100 μL富集液涂布于卵磷脂吐溫80-營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或虎紅培養(yǎng)基上確認(rèn)樣品中是否含有微生物。接菌試驗通過的標(biāo)準(zhǔn)為，微生物樣品和微生物對照的檢測結(jié)果為陽性，未接菌的產(chǎn)品樣品檢測結(jié)果應(yīng)為陰性。

3 結(jié)果與分析

3.1 促生長能力測試

促生長能力測試結(jié)果見表1。本研究收集的47株微生物菌株在富集培養(yǎng)基MTAT中生長良好，ATP生物熒光增幅檢測結(jié)果均為陽性，并且在卵磷脂吐溫80-營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或虎紅培養(yǎng)基上生長良好，表明富集培養(yǎng)基MTAT的促生長能力測試符合要求。

促生長能力測試主要考察MTAT培養(yǎng)基對菌株的富集培養(yǎng)能力，試驗菌株的選擇尤為關(guān)鍵。本研究結(jié)合微生物分類學(xué)特征和生長特性，選取與化妝品原料與生產(chǎn)環(huán)境相關(guān)的47種細(xì)菌、酵母和霉菌代表菌株，用于考察MTAT培養(yǎng)基的富集能力。從微生物分類特征上看，選取的菌株包括28株細(xì)菌(15株革蘭氏陰性細(xì)菌和13株革蘭氏陽性細(xì)菌)，5株酵母菌和14株霉菌，具有良好的代表性。從生理特性上看，既有生長速度快的代表菌株，又有對營養(yǎng)苛求、生長較為緩慢的代表菌種，如聚多曲霉(Aspergillussydowii)CICC 40930，繩狀青霉(Penicilliumfuniculosum)CICC 40279，宛氏擬青霉(Paecilomycesariotii)CICC 4025，拜耳接合酵母(Zygosaccharomycesbailli)CICC 1281和樹脂枝孢霉(Cladosporiumresinae)CICC 41706，在富集培養(yǎng)基MTAT中培養(yǎng)48 h后，ATP生物熒光增幅檢測結(jié)果才為陽性。這5株真菌是生長緩慢的菌株的代表，為今后研究中生長緩慢代表菌株的選擇提供了重要的依據(jù)。

3.2 產(chǎn)品適用性試驗

3.2.1 樣品影響測試

樣品影響測試主要測試化妝品產(chǎn)品的本底信號值，確保化妝品配方成分不會影響ATP生物熒光增幅法的檢測。檢測結(jié)果見表3，培養(yǎng)基空白的信號值在167～285 RLU，遠(yuǎn)低于檢測方法規(guī)定的 1 000 RLU，表明富集培養(yǎng)基MTAT本底信號符合要求。產(chǎn)品樣品的信號值在87～199 RLU，也遠(yuǎn)低于3倍培養(yǎng)基空白信號值的要求，并且通過涂布平板確認(rèn)化妝品樣品中未見微生物污染。此外，ATP對照、微生物對照、ATP樣品和微生物樣品的信號值均大于3 倍培養(yǎng)基空白的信號值，并且測試產(chǎn)品中ATP回收率在73.8%～106.8%，高于25%的標(biāo)準(zhǔn)推薦值，表明本研究選取的6種產(chǎn)品均通過樣品影響測試。

3.2.2 接菌試驗

接菌試驗主要是證明化妝品中的抑菌作用能否被富集培養(yǎng)基有效中和，檢測結(jié)果見表4。培養(yǎng)基空白的信號值在145～178 RLU，遠(yuǎn)低于檢測方法規(guī)定的1 000 RLU，產(chǎn)品樣品的信號值在86～198 RLU，檢測結(jié)果為陰性，并且涂布平板確認(rèn)化妝品樣品中未見微生物污染。而接種試驗菌懸液的微生物對照和微生物樣品，ATP生物熒光增幅法檢測結(jié)果均為陽性，并且通過平板確認(rèn)微生物對照和微生物樣品中微生物生長良好，表明本研究選取的6種產(chǎn)品均通過接菌試驗。

綜合樣品影響測試和接菌試驗的檢測結(jié)果，ATP生物熒光增幅法適用于本研究所選洗發(fā)水、沐浴液、護(hù)發(fā)素、定型水、面霜和面膜中微生物的快速篩選與檢測，為后續(xù)該方法進(jìn)行方法驗證和方法適用性研究奠定了基礎(chǔ)。

表3 樣品影響測試結(jié)果Table 3 Sample effect test results

表4 接菌試驗結(jié)果Table 4 Spiking test results

4 結(jié)論

本研究收集的與化妝品原料及其生產(chǎn)環(huán)境相關(guān)的47株代表性菌株，在富集培養(yǎng)基MTAT中生長良好，均通過了促生長能力測試；選取的清潔類、護(hù)理類、美容修飾類中6種化妝品均符合樣品影響測試和接菌試驗檢測方法的要求。因此，ATP生物熒光增幅法具有在化妝品及相關(guān)領(lǐng)域開展微生物快速篩選與檢測的良好應(yīng)用前景。