異硫氰酸苯酯柱前衍生RP-HPLC法同時測定蓮霧中15種游離氨基酸的含量

張國華,吳光斌,陳昭華,張 珅,陳發河

(集美大學食品與生物工程學院,福建廈門 361021)

蓮霧(Syzygiumsamarangenese[Blume]Merrill & L.M. Perry)又名洋浦桃、水蒲桃、爪哇浦桃等,屬桃金娘科蒲桃屬喬本植物,起源于馬來半島、安達曼和尼科巴群島[1]。早在17世紀就引種到臺灣,目前在中國福建、廣東、海南等多地均有栽培[2-3]。蓮霧果實營養豐富,風味獨特,鮮食生津解渴,亦可加工成果汁和罐頭食品[4-6]。但是由于蓮霧果實組織幼嫩疏松、生命活動旺盛,采后如不及時處理容易發生果肉絮狀綿軟癥狀,食用品質急劇下降,失去商用價值[7-8]。

氨基酸作為蛋白質的分解產物是評價食品質量及營養價值的重要指標[9-11]。目前氨基酸的分析方法有很多種,主要包括氨基酸自動分析儀、高效液相色譜法、毛細管電泳法、氣相色譜法等[12],其中以柱前衍生高效液相色譜(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)法測定游離氨基酸最為廣泛,具有靈敏度高、重復性好,操作費用較低等優點[13]。常用的衍生試劑有:鄰苯二甲醛(OPA)[14]、2,4-二硝基氟苯(DNFB)[15]、芴甲氧羰酰氯(FMOC-Cl)[16]、乙氧基亞甲基丙二酸二乙酯(DEEMM)[17]和異硫氰酸苯酯(PITC)等[18]。在這些衍生試劑中,PITC與氨基酸的反應迅速、產物單一穩定、衍生后易除去多余的試劑且不會影響檢測靈敏度,已成為一種經典的氨基酸衍生方法,已廣泛用于檢測黃酒[19]、西瓜[20]、青豆[21]和食用海藻[22]中的氨基酸。目前利用HPLC檢測蓮霧果實中的游離氨基酸的研究甚少,本文建立了一種柱前衍生化高效液相色譜同時測定蓮霧果實中15種游離氨基酸的方法,以期為今后蓮霧果實游離氨基酸含量的測定研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

臺灣“蜜風鈴”蓮霧(Syzygiumsamarangenese[Blume]Merrill & L.M. Perry) 購于廈門中埔臺灣水果集散中心,挑選大小適中、表皮顏色和成熟度一致且無損傷的果實,在溫度(4±0.5) ℃,濕度85%±2%的條件下進行貯藏;15種氨基酸對照品(L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-組氨酸、L-丙氨酸、L-蘇氨酸、L-精氨酸、L-脯氨酸、L-纈氨酸、L-甲硫氨酸、L-酪氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-半胱氨酸、L-苯丙氨酸和L-賴氨酸) 純度均≥98%,北京索萊寶科技有限公司;異硫氰酸苯酯、三乙胺、三水合乙酸鈉 均為色譜純,上海麥克林生化科技有限公司;乙腈 色譜純,Sigma-Aldrich公司。

Agilent 1260型高效液相色譜儀 美國Agilent公司;MS3 digitial旋渦振蕩器 德國IKA公司;Quintix?分析天平 北京賽多利斯儀器系統有限公司;PE20K型pH計 梅特勒-托利多儀器;GL-20G-II-D離心機 上海安亭科學儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液配制 單一標準儲備液:用0.1 mol/L鹽酸配制質量濃度為500 mg/L的15種氨基酸標準溶液,4 ℃保存。混合標準工作液:分別移取適量的各單一標準儲備液,用0.1 mol/L鹽酸稀釋成2、10、50、100、250、500 mg/L配成混合標準溶液,待衍生化。

1.2.2 樣品提取 取10 g新鮮蓮霧果肉樣品,加入15 mL超純水,4 ℃超聲(400 W,40 kHz)30 min,再加入15 mL 80%乙醇,4 ℃過夜后,10000 r/min離心20 min,水溫38 ℃以下,減壓蒸餾出去乙醇,待樣品成糊狀時,逐漸減壓取出燒瓶,在剩余物中加入5 mL乙醚,用分液漏斗反復抽提兩次,抽提后收集水層,用0.1 mol/L鹽酸定容至5 mL,制得樣品提取液,待衍生化。

1.2.3 衍生化操作 準確吸取樣液/標液1 mL于10 mL離心管中,分別加入14%三乙胺-乙腈溶液和1.2% PITC-乙腈溶液各0.5 mL,渦旋10 s,室溫靜置30 min,加入2 mL正己烷,漩渦60 s,室溫靜置10 min,10000 r/min,離心5 min,棄去上清。再次加入2 mL正己烷重復后續操作,取下層清液經0.45 μm有機濾膜過濾后上HPLC進行分析。

1.2.4 色譜條件 色譜柱:Atlantis T3柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相A:0.1 mol/L乙酸鈉緩沖液(pH6.5,含0.5%三乙胺);流動性B:乙腈-水(4∶1);流速:1.0 mL/min;檢測波長:254 nm;柱溫:35 ℃;進樣量:20 μL;洗脫程序為:0～3 min,100% A;15～20 min,85% A;25 min,80% A;30～35 min,75% A;40 min,70% A;45 min,60% A;50 min,20% A;55 min,10% A;56～60 min,0% A;61～70 min,100% A。

1.3 數據處理

使用Microsoft Excel 2016軟件對數據進行處理,使用Adobe Photoshop軟件對圖像進行處理。

2 結果與分析

2.1 色譜柱的選擇

考察了InfinityLab Poroahell C18柱(4.6 mm×150 mm,4 μm)和Atlantis T3(4.6 mm×250 mm,5 μm)在乙酸鈉水溶液(pH=6.5,A)和乙腈-水(4∶1,B)梯度洗脫條件下的分離效果。結果如圖1顯示,Atlantis T3色譜柱具有良好的分離效果,15種氨基酸的分離度均大于1.5。因此實驗選用Atlantis T3色譜柱。

圖1 混合氨基酸標準品在InfinityLab Poroahell C18柱(A)及Atlantis T3柱(B)中的液相色譜圖Fig.1 The chromatogram of 15 amino acids onInfinityab Poroahell C18(A)and Atlantis T3(B)columns注:1:天冬氨酸;2:谷氨酸;3:組氨酸;4:精氨酸;5:蘇氨酸;6:丙氨酸;7:脯氨酸;8:酪氨酸;9:纈氨酸;10:甲硫氨酸;11:異亮氨酸;12:亮氨酸;13:半胱氨酸;14:苯丙氨酸;15:賴氨酸,圖2～圖3同。

2.2 流動相體系的選擇

PITC柱前衍生液相色譜法測定氨基酸常采用乙腈-水和0.1 mol/L乙酸鈉水溶液作為流動相。本實驗比較了在乙酸鈉水溶液中添加0.5%三乙胺和不添加三乙胺對峰型的影響,結果如圖2和圖1B顯示,添加三乙胺后各組分的色譜峰形得到明顯的改善。實驗中還進一步考察了乙酸鈉水溶液的pH為6.2、6.3、6.4、6.5對氨基酸保留時間及分離度的影響,結果顯示,當pH為6.5時,分離度和峰型最為理想。因此,本實驗最終選用0.1 mol/L乙酸鈉(pH6.5,含0.5%三乙胺)和乙腈-水(4∶1)作為流動相進行洗脫。

本實驗首先采用的是等度洗脫的方式,結果發現目標成分很難有效分離,改用梯度洗脫的方式后有較大的改善,當濃度梯度為0～3 min,100% A;15～20 min,85% A;25 min,80% A;30～35 min,75% A;40 min,70% A;45 min,60% A;50 min,20% A;55 min,10% A;56～60 min,0% A;61～70 min,100% A條件時,15種氨基酸能有效分離,滿足實驗要求。在前述優化的色譜條件下對標準品和樣品進行測定,15種氨基酸混合標準品及蓮霧樣品的液相色譜圖見圖3。

2.3 標準曲線、線性范圍和檢出限測定結果

在優化的實驗條件下,以混合標準工作液的濃度為橫坐標(x),其衍生物峰面積為縱坐標(y),繪制標準曲線,根據信噪比(S/N=3)和(S/N=10)分別確定檢出限(LODs)以及定量限(LOQs)。結果見表1,15種氨基酸標準品呈現良好的線性關系,相關系數范圍為0.9954～0.9996,檢出限為0.08～0.35 mg/L,定量限為0.35～1.25 mg/L。

表1 15種氨基酸的標準曲線、相關系數、檢出限和定量限Table 1 Regression equations,correlation coefficients,limits of detection(LODs)and limits of quantification(LOQs)for 15 amino acids

圖2 流動相添加三乙胺的液相色譜圖Fig.2 Liquid chromatogram of triethylamine in mobile phase

圖3 15種氨基酸混合標準品(A)及蓮霧樣品(B)的液相色譜圖Fig.3 The chromatogram of 15 aminoacids(A)and wax apple sample(B)

2.4 回收率和精密度測定結果

為了驗證方法的準確度,通過向蓮霧果實樣品中加標以測定各組分的回收率,加標水平按本底值的約0.5(a)、1.0(b)和1.5(c)倍添加,按照1.2.2進行處理。每個加標水平平行測定6次,計算平均加標回收率和相對標準偏差(RSD),見表2。結果顯示,各組分的平均加標回收率為85.61%～106.68%,RSD均小于5%,說明該方法精密度良好,準確度高。

表2 15種氨基酸在蓮霧樣品中的加標回收率及相對標準偏差(n=6)Table 2 Average recoveries and RSD of 15 amino acids in wax apple samples(n=6)

2.5 樣品測定

表3 蓮霧果實中15種游離氨基酸的含量(n=3)Table 3 The content of 15 amino acids in wax apple(n=3)

采用上述優化的試驗方法,對蓮霧果實中的游離氨基酸含量進行測定,結果見表3。在蓮霧果實中共檢測到12種游離氨基酸,包含有7種人體必需氨基酸和2種兒童必需氨基酸。相關研究表明,不同水果中游離氨基酸的含量不盡相同,荔枝中γ-氨基丁酸含量較高,香蕉中蘇氨酸和絲氨酸含量較高,百香果中脯氨酸含量較高[23]。而在蓮霧果實中苯丙氨酸、酪氨酸、脯氨酸、纈氨酸和精氨酸含量較高,每種水果中所含有的各種游離氨基酸比例不同,可為開發不同功能食品提供基礎的數據參考。氨基酸作為生物體內蛋白質分子的基本組成單位,與人體生命活動密切相關。其中,苯丙氨酸可參與消除腎及膀胱功能的損耗;脯氨酸與血紅蛋白密切相關;纈氨酸可作用于黃體、乳腺及卵巢;精氨酸不僅具有促進胰島素生成及分泌的作用,還有助于生長發育和創口愈合[24];賴氨酸不僅可以調節人體代謝平衡,促進兒童智力的發育,還能防止細胞退化;異亮氨酸可參與胸腺、脾臟及腦下腺的調節以及代謝;亮氨酸可參與平衡異亮氨酸;谷氨酸具有生成紅細胞、改善腦細胞營養的作用,是治療神經衰弱和記憶力減退的有效成分[25]。

3 結論

本實驗構建了PITC柱前衍生高效液相色譜法測定蓮霧果實中15種游離氨基酸含量的方法,該方法15種氨基酸能有效分離,各氨基酸組分的線性范圍較寬,在2～500 mg/L范圍內呈現良好的線性關系,檢出限為0.08～0.35 mg/L,定量限為0.35～1.25 mg/L,加標回收率為85.61%～106.68%,RSD均小于5%,說明方法精密度好,準確度高,適用于蓮霧果實游離氨基酸含量的分析。