鐵皮石斛糖蛋白對皮膚炎癥期的調控作用及機制

趙 倩,戴天浥,洪文龍,周麗免,蘇海冉,田 洋,4,*,白忠彬,*

(1.云南農業大學食品科學技術學院,云南昆明 650201; 2.云南農業大學國家辣木加工技術研發專業中心,云南昆明 650201; 3.云南斛哥藥業有限公司,云南普洱 665000; 4.食藥資源開發與利用教育部工程中心,云南昆明 650201)

鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKinura et Migo,DOKM)為石斛屬蘭科多年生草本植物,全球約1400多種,主要分布于亞洲的熱帶地區[1]。我國石斛屬植物共76種,鐵皮石斛是中國藥典收錄的5種石斛之一,具有益胃生津、滋陰清熱、潤肺止咳等功效[2]。在2018年鐵皮石斛被國家衛健委收錄為新資源食品。已經有研究報道,石斛與機體多個部位的炎癥反應密切相關,如對于糖尿病引發的心肌病,鐵皮石斛提取物可通過抑制氧化應激、炎癥反應,降低炎癥因子白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的分泌來減輕心肌病癥狀[3]。對于胃腸道疾病,鐵皮石斛多糖對治療急性結腸炎小鼠具有明顯作用,其機理為通過β-arrestin1信號通路抑制NLRP3炎性體[4]。在脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導的巨噬細胞炎癥模型中,石斛通過抑制一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,iNOS),環氧化酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)的表達以及絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)途徑中的細胞外調節蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)的磷酸化達到抑制炎癥的作用[5]。

皮膚傷口愈合一般經歷炎癥、新生肉芽組織填充和瘢痕形成三個階段[6],其組織學變化為傷口部位發生凝血,細胞因子分泌及后續的炎癥細胞聚集,細胞外基質填充損傷部位,愈合后瘢痕組織的降解和吸收[7]。正常愈合過程中,在傷口受損的初期,大量的單核細胞聚集于受損部位,逐漸轉化為活化的巨噬細胞,對壞死組織和細胞碎片進行吞噬,并分泌大量的炎癥因子,同時釋放抗菌物質,促進創面的炎癥反應[8]。到創面炎癥的后階段,創面的炎癥被抑制,巨噬細胞主要分泌生長轉化因子(transforming growth factor,TGF-β)和血管內皮生長因子(Vascular Endothelial Grown Factor,VEGF)等蛋白因子,使成纖維細胞、內皮細胞等修復細胞遷移至創面,肉芽組織開始覆蓋病損組織,新生血管大量生成,逐步進入創面修復時期[9-10]。

鐵皮石斛作為新資源食品,其在藥食同源領域具有諸多功效,但其促進傷口愈合及其機理未見報道。本實驗采用小鼠皮膚損傷模型,檢測了鐵皮石斛糖蛋白對小鼠皮膚損傷愈合的促進作用,同時選用巨噬細胞株RAW264.7作為體外研究對象,應用MTT、ELISA、RT-PCR、WB等方法檢測鐵皮石斛糖蛋白對RAW264.7細胞分泌炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6以及NF-κB信號通路的影響,研究了鐵皮石斛糖蛋白在傷口愈合過程中的炎癥調控作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

C57雄性小鼠7-8周齡,體重(20±2) g 購自常州卡文斯實驗動物有限公司,飼養于云南農業大學工程中心動物飼養室(N000013);RAW264.7小鼠單核巨噬細胞 由云南農業大學云南辣木所提供;三年生林下仿生鐵皮石斛 來自云南省普洱市斛哥莊園,于12月份采集;高糖DMEM培養基 美國BI公司;胎牛血清(fetal bovine serum,FBS) 美國Hyclone公司;二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)、0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液、RIPA細胞裂解液、磷酸酶抑制劑、青鏈霉素 北京索萊寶科技有限公司;逆轉錄試劑盒、SYBR染料 南京喏唯贊生物科技有限公司;抗體AMPK、P-AMPK、NF-κB、P-NF-κB、VEGF、IL-6、TNF-α、ECL發光液 遼寧萬類生物科技有限公司;BCA試劑盒 碧云天公司。

Epoch2全波長酶標儀 美國BioTek公司;LightCycler480 II熒光定量PCR儀 德國Roche公司;JY-scz2電泳儀 美國Bio-Rad公司;K3000mini化學發光成像系統 北京科創銳新生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 鐵皮石斛糖蛋白的制備 參照白忠彬[11]方法,在此基礎上適當修改。試驗采用熱水浸提法,采取工藝為提取料液比1∶10,浸提溫度70 ℃,提取時間為90 min,提取次數3次,(紗布過濾)合并濾液;4000 r/min,離心15 min,合并上清液;濃縮(減壓濃縮),濃縮到一定體積后,加5倍體積95%乙醇,靜置24 h,離心取沉淀,沉淀用適量無水乙醇洗滌2次,冷凍干燥得到石斛糖蛋白粉,于常溫儲存。

1.2.2 RAW264.7細胞培養 取出低溫保存的1 mL細胞株,快速融化,放于15 mL無菌離心管中,加入5 mL培養液混勻后,以1500 r/min離心3 min,去上清將細胞沉淀轉移至100 mm培養皿中,于37 ℃、5% CO2條件下培養。待細胞生長至80%,用磷酸緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)沖洗2次,0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液在37 ℃培養箱中消化3～4 min,用無血清培養基吹打底部細胞,使細胞脫落。取細胞懸液以1500 r/min離心3 min,棄上清,加入新鮮培養液使底部細胞沉淀懸浮于培養液中。取細胞混懸液按1∶3傳代放于3個培養皿中,并分別補充培養液,于 37 ℃、5% CO2及飽和濕度條件下繼續培養。

1.2.3 MTT法檢測細胞毒性實驗 以200 μL/孔(104個細胞)接種細胞到96孔板上,于37 ℃、5% CO2環境下培養24 h,用PBS清洗未貼壁細胞,添加25、50、100、200 μg/mL鐵皮石斛糖蛋白,對照組更換新鮮培養基。每孔200 μL,繼續培養24 h。培養完成后,每孔用100 μL新鮮培養基配制的0.25 mg/mL的MTT溶液37 ℃避光孵育4 h顯色。吸去培養基,PBS洗2次,每孔添加150 μL DMSO,輕微振蕩使紫色結晶物溶解。酶標儀于490 nm測定吸光值。細胞存活率計算公式如下:

表1 RT-PCR擴增條件Table 1 RT-PCR amplification conditions

表2 RT-PCR引物序列Table 2 RT-PCR primer sequence

式中:OD0為調零孔;OD1為空白孔;OD2為實驗孔。

1.2.4 RT-PCR法檢測RAW264.7細胞中細胞因子mRNA表達水平 將處于對數生長期RAW264.7細胞按每皿1.2×106個細胞接板于60 mm培養皿內,培養24 h后進行添加鐵皮石斛糖蛋白。對照組更換新鮮培養基,石斛糖蛋白組添加鐵皮石斛糖蛋白終濃度分別為25、50、100 μg/mL。添加石斛糖蛋白干預12、24、48、72 h后,按照試劑盒說明書提取總RNA,將RNA按照試劑盒說明書逆轉錄為cDNA,按表1的擴增條件加樣上機。RT-PCR引物序列見表2。

1.2.5 ELISA法檢測細胞上清中炎癥因子的分泌 將處于對數生長期的細胞按照5×104個/mL每孔200 μL接種于96孔板中37 ℃,5% CO2培養24 h。在檢測IL-1β時,先用1 μg/mL的LPS誘導1 h然后添加鐵皮石斛糖蛋白。對照組更換新鮮培養基,石斛糖蛋白組終濃度為25、50、100 μg/mL。培養24 h后,收集上清液于200 μL的離心管里。每組5個復孔。上清液1200 r/min離心10 s后吸取上層清液分裝后放于-20 ℃冰箱里備用。

從4 ℃冰箱里取出試劑盒,室溫平衡30 min,取出事先制備好的細胞上清液振蕩離心混勻后,按照試劑盒說明進行TNF-α、IL-1β表達量的測定。

1.2.6 蛋白印跡法檢測細胞中蛋白的表達 取對數生長期RAW264.7細胞以3×105個/mL接板于60 mm培養皿內,每皿4 mL培養24 h后待細胞貼壁。對照組更換新鮮培養基,石斛糖蛋白終濃度分別為25、50、100 μg/mL。繼續培養24 h后棄去培養液,預冷PBS清洗2次,吸干PBS后,加入蛋白裂解液RIPA冰上裂解20 min,進行總蛋白提取。隨后根據BCA試劑盒測定蛋白濃度,根據濃度制備好蛋白樣品備用。SDS-PAGE電泳先采用50 V低電壓跑30 min,后用100 V高電壓跑100 min左右。電泳后在200 mA,60 min冰浴轉到PVDF膜上,5%脫脂奶粉封閉膜1.5 h,TBST清洗3次,每次5 min。隨后加入一抗(TGF-β、VEGF、IL-6、TNF-α、IL-1β、P-IκB、IκB、NF-κB、P-NF-κB)4 ℃孵育過夜。TBST洗膜后與1∶5000稀釋的標記有辣根過氧化物酶(horse radish peroxidase,HRP)的鼠抗或者兔抗室溫孵育1 h,洗膜后用發光液顯色,采用image J對目的條帶進行灰度分析。

1.2.7 鐵皮石斛糖蛋白對小鼠傷口的愈合影響 動物實驗根據國際指南進行,實驗方案經云南農業大學機構動物倫理委員會批準。選取20只C57小鼠,每只小鼠背部左右兩側用刀片劃開約1 cm對稱的兩對刀口,左側涂抹凡士林,右側涂抹用凡士林配制的2%鐵皮石斛糖蛋白(預實驗對0.5%、1%、2%、5%等濃度實驗結果顯示,當濃度為2%時,愈傷效果最佳),每天早晚各一次,連續7 d,停藥23 d,分別于給藥的第7 d、停藥第5 d(即給藥12 d)、第23 d(即給藥30 d)用乙醚麻醉后拍照觀察實驗結果。事后用Image Pro對傷口面積進行分析,GraphPad Prism 5.01進行統計學分析愈合程度。

圖2 鐵皮石斛糖蛋白對RAW264.7細胞炎癥因子mRNA表達的影響Fig.2 Effect of DOKMG on the mRNA expression of inflammatory factors in RAW264.7 cells注:*表示與對照組相比兩組之間的差異；*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001；圖4～圖7同。

式中:St為測定當天的傷口面積,S為手術當天的傷口面積。

1.3 統計分析

實驗數據采用GraphPad Prism 5.01統計作圖軟件進行處理,組間比較采用單因素方差分析和獨立t檢驗,* 表示P<0.05,差異顯著,** 表示P<0.01,差異高度顯著,***,表示P<0.001,差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 鐵皮石斛糖蛋白對RAW264.7細胞活力的影響

用MTT法檢測鐵皮石斛糖蛋白對RAW264.7細胞生長的調節作用。結果如圖1所示,在實驗劑量下,鐵皮石斛糖蛋白的添加未影響細胞的存活率。因此,在本實驗條件下,鐵皮石斛糖蛋白在25～200 μg/mL的劑量下對RAW264.7細胞無毒害作用。

圖1 鐵皮石斛糖蛋白對RAW264.7活力的影響Fig.1 Effect of DOKMG on RAW264.7 vitality

2.2 鐵皮石斛糖蛋白對IL-1β、IL-6、TNF-α炎癥因子基因的影響

圖3 鐵皮石斛糖蛋白對炎性關鍵酶mRNA表達的影響Fig.3 Effect of DOKMG on the mRNA expression of inflammatory key enzymes

圖4 鐵皮石斛糖蛋白促進RAW264.7細胞分泌炎癥因子Fig.4 DOKMG promotes the secretion of inflammatory cytokines in RAW264.7 cells注:圖B中#表示與LPS組相比兩組之間的差異；#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001。

IL-1β、IL-6、TNF-α是炎癥反應中常見的促炎因子,其表達量可間接反映炎癥反應的程度。隨著時間的推移,IL-1β、IL-6、TNF-α的相對表達量呈現先上升后下降的趨勢,且在24 h達到峰值(圖2A、B、C)。隨著濃度的增加,IL-6、TNF-α的相對表達量也隨之增加,在100 μg/mL時相對表達量最高。如圖2D、E、F所示,與24 h的對照組相比,IL-1β在峰值(24 h,100 μg/mL)相對表達量增加了10.09倍,IL-6在峰值(24 h,100 μg/mL)相對表達量增加了20.45倍,TNF-α的峰值(24 h,100 μg/mL)相對表達量增加了0.95倍,均出現極顯著差異(P<0.001)。炎癥因子的基因表達預示,在鐵皮石斛糖蛋白刺激24 h的促炎效果最佳,因此后續炎癥因子檢測均選用24 h這個時間點。

2.3 鐵皮石斛糖蛋白對iNOS、COX-2基因表達的影響

iNOS可催化L-精氨酸不斷地產生NO,且其產生能活化自身的環氧合酶COX,而COX-2與炎癥密切相關[12]。由圖3A、B所示,50、100 μg/mL各時間點的iNOS,COX-2的mRNA的表達量均在對照組之上。隨著時間的推移,COX-2與iNOS的相對表達量均出現先上升后下降的趨勢,iNOS在48 h達到峰值。隨著濃度的增加,COX-2的相對表達量也隨之增加。與24 h的對照組相比,COX-2在峰值(24 h,100 μg/mL)的表達量增加了4.14倍,與48 h的對照組相比,iNOS在峰值(48 h,50 μg/mL)的表達量增加了3.49倍。結果表明,鐵皮石斛糖蛋白能促進炎性關鍵酶的mRNA的表達。

2.4 鐵皮石斛糖蛋白對RAW264.7細胞炎癥因子分泌量的影響

TNF-α作為腫瘤壞死因子,主要由巨噬細胞產生,是機體發生炎癥反應的重要促炎因子。IL-1β是IL-1家族的一種,同樣具有介導炎癥的作用,在生理狀態下巨噬細胞IL-1β的分泌量較少。LPS具有誘導RAW264.7細胞大量分泌IL-1β的作用,當細胞分泌的炎癥因子因分泌量過少而不易檢查時,加入LPS可促進檢測的順利完成[13]。如圖4所示,隨著鐵皮石斛糖蛋白的濃度的升高,在其濃度為100 μg/mL時，TNF-α的分泌量呈現極顯著增加(P<0.001),對照組中僅為0.52 μg/mL,而當鐵皮石斛糖蛋白濃度上升為100 μg/mL時,分泌量達到1.99 μg/mL。IL-1β分泌量未能達到檢測閾值,采用LPS誘導1 h后,再用鐵皮石斛糖蛋白刺激,其分泌量由118.52 pg/mL達到272.81 pg/mL。此實驗結果表明,鐵皮石斛糖蛋白能促進炎癥因子分泌。

2.5 鐵皮石斛糖蛋白對炎癥相關蛋白表達水平的影響

如圖5所示,經過鐵皮石斛糖蛋白處理24 h后巨噬細胞中的TGF-β、VEGF對鐵皮石斛糖蛋白呈濃度依賴性變化,隨著濃度的升高,其蛋白表達量逐漸增強。而炎癥因子IL-6、TNF-α、IL-1β的蛋白表達也隨著石斛糖蛋白濃度的增加而增加,且在濃度達到100 μg/mL時有顯著性差異(P<0.05),TNF-α、IL-1β、IL-6的相對蛋白表達量分別為1.41、3.01、1.61。

圖5 鐵皮石斛糖蛋白促進炎癥因子蛋白表達Fig.5 DOKMG promotes the expression of inflammatory cytokines

2.6 鐵皮石斛糖蛋白對信號通路NF-κB的影響

為了了解鐵皮石斛糖蛋白促進炎癥的機制是否與NF-κB信號通路有關,檢測不同濃度鐵皮石斛糖蛋白處理后NF-κB信號通路上各項蛋白的變化情況。如圖6所示,當鐵皮石斛糖蛋白的濃度達到100 μg/mL時,NF-κB的上游蛋白IκB的磷酸化程度相比對照組高度顯著(P<0.01)增加了0.99,當鐵皮石斛糖蛋白處理的濃度為50 μg/mL時,NF-κB的磷酸化程度顯著(P<0.05)增加了0.85。上述結果表明,鐵皮石斛糖蛋白能顯著促進NF-κB信號通路相關蛋白的磷酸化。據文獻報道,AMPK是一種參與能量穩態的酶,能調節炎癥反應,與NF-κB、COX-2有一定關聯[14]。結果表明,在經過25 μg/mL的鐵皮石斛糖蛋白刺激后其磷酸化相比對照組有顯著增強(P<0.05)。因此,鐵皮石斛糖蛋白可能通過AMPK介導的NF-κB信號通路促進炎癥發生。

圖6 鐵皮石斛糖蛋白通過NF-κB信號通路促進炎癥發生Fig.6 DOKMG promotes inflammation through theNF-κB signaling pathway

2.7 鐵皮石斛糖蛋白對小鼠傷口愈合的影響

通過小鼠皮膚損失模型檢測了鐵皮石斛糖蛋白是否具有促進傷口愈合的功效。由圖7可知,相對傷口愈合率以時間依賴的方式增加,鐵皮石斛糖蛋白組在第7和第12 d愈合率達到65.45%、72.45%,比凡士林為對照的組增加了15.20%、12.36%。本結果結合前面的細胞及炎癥因子的檢測,預示著鐵皮石斛糖蛋白可能在受損早期(炎癥期)通過調節炎癥因子表達來促進小鼠皮膚傷口愈合。

圖7 鐵皮石斛糖蛋白對小鼠傷口的作用Fig.7 Effect of DOKMG on wound healing in mice

3 討論與結論

傷口愈合是一個復雜和動態的過程[15],包括炎癥、肉芽組織形成、瘢痕形成三個階段。炎癥階段作為傷口愈合的第一個時期,適度的炎癥反應有利于傷口的愈合。巨噬細胞在創面修復的炎癥期中起到了重要作用[16-17]。在炎癥的初期,巨噬細胞能清除壞死組織,細胞碎片以及其他機體組織中的異物,分泌轉化生長因子(TGF-β),成纖維細胞生長因子(FGF)血管生長因子(VEGF)等細胞因子,刺激成纖維細胞增殖遷移,有利于膠原沉積,肉芽組織生成。同時促進新生血管生成[18]。

NF-κB是一種核轉錄因子,與多種免疫細胞的增殖,遷移,分化緊密相關[19]。Park等發現,絲素蛋白通過NF-κB信號通路調節成纖維細胞的波形蛋白、周期蛋白、纖維連接蛋白和血管內皮生長因子的表達促進傷口愈合[20]。低溫等離子體可通過誘導活性氧ROS的產生,上調磷酸化的p65,下調IκB的表達,激活NF-κB信號傳導途徑改變成纖維細胞周期實現傷口愈合[21]。AMPK是一種能量傳感器,調節能量代謝和機體能量的儲存[22]。AMPKα1是巨噬細胞功能和表型極化的重要調節因子,與NF-κB、COX-2有一定的關聯[14]。研究結果發現,以RAW264.7為細胞系,鐵皮石斛糖蛋白刺激24 h后,NF-κB、IκB的磷酸化隨著其濃度增加相對對照組有一定的顯著性差異,意味著鐵皮石斛糖蛋白可能通過NF-κB途徑調控炎癥。與此同時,在鐵皮石斛糖蛋白濃度為25 μg/mL時,AMPK的磷酸化也相對對照組有顯著性增加,這可能暗示著AMPK與NF-κB是正相關關系,與NF-κB協同調控炎癥。

本研究發現在基因的水平上,鐵皮石斛糖蛋白能在一定時間內促進炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α和炎癥相關酶COX-2、iNOS的表達。且隨著時間的延長促進作用有所降低。這種現象可以很好地解釋鐵皮石斛糖蛋白在傷口愈合的炎癥期,先起到促炎的作用,使巨噬細胞快速清理細胞碎片和壞死的組織,將體內異物排除,隨時間推移,促炎效果減弱,降低持續炎癥給機體帶來的傷害。為更好地研究鐵皮石斛糖蛋白的促炎機理,選用促炎效果最好的24 h這個時間點對后續實驗研究,發現細胞上清分泌的炎癥因子在鐵皮石斛糖蛋白的刺激下也有所增加,這種現象同樣發生在通過WB實驗檢測的蛋白水平。Western blot實驗同時發現,鐵皮石斛糖蛋白激活了NF-κB信號通路導致炎癥加深。為驗證鐵皮石斛糖蛋白是否通過調控炎癥促進傷口愈合,建立了小鼠全程皮膚損傷模型,結果發現,相對凡士林組,石斛糖蛋白組的愈合率在第7與第12 d都出現了顯著增加(P<0.05)。從體內證明了起初的假設——鐵皮石斛糖蛋白通過調控炎癥促進傷口愈合。

目前跟炎癥相關的文獻,大部分認為炎癥是對機體是有害的,因此,研究的側重點主要在藥物的抗炎性,而早期適度的炎癥反應有利于創面的愈合[23-24],本文評價了炎癥在早期傷口愈合過程中扮演的正向調節作用,發現炎癥有利于傷口愈合的特性,但傷口愈合后期炎癥同樣會延誤受損部位的恢復。

總之,本研究在評估鐵皮石斛糖蛋白對巨噬細胞炎癥的調控的基礎上,對鐵皮石斛糖蛋白促炎的分子機理進行了初步的探索,明確了鐵皮石斛糖蛋白能明顯促進炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表達。通過本研究,可以為鐵皮石斛糖蛋白愈傷作用的機理研究提供重要的理論依據,有利于鐵皮石斛在功能食品與膳食方面的開發,促進石斛產業的可持續發展。