滇紅茶加工過程中氟蟲腈及其代謝物降解規律分析及膳食暴露評估

林 濤,彭麗媛,陳興連,劉興勇,李茂萱,徐祎然,鄒艷虹,劉宏程,*

(1.云南省農業科學院質量標準與檢測技術研究所,云南昆明 650205; 2.農業農村部農產品質量安全風險評估實驗室(昆明),云南昆明 650205; 3.云南省臨滄市鳳慶縣農產品質量安全檢測站,云南鳳慶 675900; 4.云南省昆明市動物疫病預防控制中心,云南昆明 650033)

紅茶作為我國的傳統飲用植物之一,屬全發酵茶,經萎凋、揉捻、發酵、干燥等系列工藝加工而成[1]。滇紅茶作為云南省紅茶的代表,在全國甚至世界上都享有盛譽,也是我國茶葉出口中的主要種類之一[2]。農藥殘留一直是茶葉質量安全重點關注的對象,近年來,紅茶中的農藥殘留也不斷引起社會的廣泛關注[3-5],而紅茶因其加工工藝相對簡單,相關的農藥在其加工過程中的殘留變化規律目前尚不明確,缺乏必要的基礎數據。

目前,紅茶中使用的農藥種類較多,但是我國的限量標準GB 2763-2019[6]中只針對茶葉中的苯醚甲環唑、吡蟲啉、噠螨靈、啶蟲脒、多菌靈等65種農藥殘留進行了規定,遠小于紅茶中檢出的農藥種類。氟蟲腈作為苯基吡唑類殺蟲劑的代表,具有廣譜殺蟲效果,其對水生生物以及蜜蜂具有一定的毒性,我國農業部已于2009年禁止其用于茶葉及蔬菜水果的種植過程中[7],然而,根據本實驗室近年來對于紅茶的監控數據顯示,紅茶中的氟蟲腈在近年來時有檢出,但其來源不明,可能為隱性農藥添加或者其在土壤長期殘留后隨茶樹的代謝進入其葉片中,且在紅茶加工過程中的殘留降解變化規律不明確,需進一步系統研究。

基于此,本研究以滇紅茶為研究對象,通過對葉片外源噴灑氟蟲腈及其代謝物,采摘后監測其加工過程中氟蟲腈及其代謝物的殘留變化,并基于其中的氟蟲腈及其代謝物殘留量,對其降解變化規律及膳食評估進行研究,為科學引導消費和農藥的科學評估提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

滇紅茶茶樹(大葉種) 云南省臨滄市鳳慶縣;Cleanert TPT固相萃取柱 天津博納艾杰爾科技有限公司;氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈砜、氟蟲腈亞砜標準物質(1000 μg/mL) 農業部環境保護科研監測所;甲醇、乙腈(色譜純) 德國merck公司;甲苯(優級純)、氯化鈉(分析純)、無水硫酸鈉(分析純) 國藥集團化學試劑北京有限公司;純凈水 杭州娃哈哈集團。

API 5500 Q TRAP三重四極桿質譜儀 美國AB SCIEX公司;1290Ⅱ型超高效液相色譜儀、ZORBAX RRHD C18色譜柱(2.1 mm×50 mm,1.8 μm) 美國Agilent公司;AE-100型電子分析天平 瑞士METTLER TOLEDO公司;渦旋振蕩器 美國Thermo Scientific公司;TGL-15B型高速臺式離心機 上海安亭科學儀器廠;HY-5型回旋式振蕩儀 江蘇省金壇市環宇科學儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 氟蟲腈及其代謝物測定

1.2.1.1 標準溶液配制 準確吸取1.00 mL氟蟲腈及其3種代謝物標準物質,用甲醇稀釋成濃度為10.0 mg/L的標準儲備液。再準確量取一定體積的氟蟲腈及其3種代謝物標準儲備溶液,用甲醇稀釋得到0.100 mg/L標準工作溶液,于-20 ℃下保存。

1.2.1.2 色譜條件 采用甲醇和水溶液作為流動相,流速:0.20 mL/min;柱溫:35 ℃;進樣量:1.00 μL,梯度洗脫參數見表1。

表1 梯度洗脫參數Table 1 The parameters of gradient elution

1.2.1.3 質譜條件 采用ESI源,負離子掃描;MRM監測模式。相關氣體條件為:GS1霧化氣55 L/h;GS2輔助加熱氣55 L/h;氣簾氣20 L/h;噴霧電壓-5500 V;輔助加熱氣溫度550 ℃;氟蟲腈及其代謝物的離子對條件如表2所示。

1.2.1.4 樣品制備 滇紅茶的加工方法參照NY/T 780-2004(紅茶)[8],滇紅茶鮮葉以及經過萎凋、揉捻、發酵3個加工工序得到的半成品樣品中含水量較大,故按照鮮樣進行樣品制樣,即將所取樣品經勻漿機勻漿后待測;滇紅茶經曬干后的樣品因其含水量較低,故直接經粉碎機粉碎,過0.3 mm篩,待測。

1.2.1.5 樣品前處理 參照文獻[9-10]中的步驟并做適當改進,根據滇紅茶加工過程中不同工序中含水量的不同,分別稱取5.00 g樣品于50 mL離心管中,鮮葉以及經萎凋、揉捻、發酵3個加工工序得到的半成品樣品加入5.00 mL純凈水,而滇紅茶經曬干后的樣品中加入10.0 mL純凈水,渦旋振蕩1.00 min,再靜置10.0 min后加入20.0 mL乙腈,利用高速勻漿機12000 r/min充分勻漿2.00 min,再加入2.00 g氯化鈉,渦旋振蕩5.00 min,在5000 r/min下離心5.00 min,取上清液5.00 mL,待凈化。

表2 氟蟲腈及其代謝物的離子對條件及相關參數Table 2 Ion pair conditions and related parameters for determination of fipronil and its metabolites

1.2.1.6 樣品凈化 滇紅茶樣品基質復雜,易對測定儀器造成污染,故本試驗中采用TPT固相萃取柱參照文獻[11-12]的方法對滇紅茶提取溶液進行凈化,首先用乙腈-甲苯(3∶1)5.00 mL活化TPT固相萃取柱,樣品提取液5.00 mL上樣后,10.0 mL乙腈-甲苯(3∶1)洗脫,洗脫液40 ℃氮氣在下吹干后1.00 mL甲醇定容,過濾膜待分析。

1.2.2 氟蟲腈及其代謝物殘留降解試驗 選擇晴朗的天氣進行殘留試驗,試驗當天風速為1.2 m/s,氣溫為23.5 ℃,噴灑時間為下午14點左右,選取10株生長狀況良好的滇紅茶茶樹,在其鮮葉上噴灑經水溶液稀釋的氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈砜和氟蟲腈亞砜混合溶液,濃度均為2 μg/mL,共噴灑200 mL,噴灑后24 h采摘,采摘方法參照NY/T 788-2018(農作物中農藥殘留試驗準則)[13],采摘量約為5 kg,其后分別于滇紅茶加工過程的萎凋、揉捻、發酵、干燥4個工序后取樣,每個工序取樣200 g,并設置3個平行,取樣后及時于-20 ℃冰箱中保存,待制樣和測定。同時設置對照組,對照組不噴灑農藥,其他操作與試驗組相同。通過測定鮮葉及萎凋、揉捻、發酵、干燥4個工序中氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈砜和氟蟲腈亞砜的含量,結合每一工序中樣品的含水量測定(測定方法參照GB 5009.3-2016 食品安全國家標準 食品中水分的測定[13]),統一換算為干樣中氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈砜和氟蟲腈亞砜含量,計算降解率,降解率計算方法為:(樣品原始濃度-每次所得含量)/樣品原始濃度,尋找各農藥在加工過程中的降解變化規律。

1.2.3 滇紅茶中氟蟲腈及其代謝物膳食評估

1.2.3.1 滇紅茶中氟蟲腈及其代謝物的各化合物的單一危害 參照文獻[14-16]中的評估方法,計算各化合物的危害商HQ,當HQ計算結果>1時,則表明膳食暴露風險較大,反之當HQ<1時,則表明膳食暴露風險較低。HQ的具體計算方法如下:

其中,殘留量采用滇紅茶最終產品中的氟蟲腈及其代謝物含量(mg/kg),參照文獻[17]及國家食品安全風險評估委員會的規定,平均膳食量按13 g/d計算,平均體重按60 kg計算,ADI(mg/kg·bw)采用《GB 2763-2019 食品安全國家標準食品中農藥最大殘留限量》[6]中的數據為0.0002 mg/kg·bw。

1.2.3.2 滇紅茶中氟蟲腈及其代謝物的總危害 采用各化合物的危害指數(HI)進行評估,同樣,當HI>1時,則表明總的膳食暴露風險較大,反之當HI<1時,則表明總的膳食暴露風險較低。HI的計算方法如下:

1.3 數據處理

利用AB analyst分析軟件對數據進行相關的分析,其他的試驗數據利用Microsoft Excel軟件進行相關的統計分析,同時繪制相應的線性范圍工作曲線等。

2 結果與分析

2.1 儀器條件的優化

質譜條件是超高效液相色譜-串聯質譜儀中最關鍵的一個條件,氟蟲腈及其代謝物在正負離子模式下都有一定的響應,相關文獻中也有報道[18-20]。本試驗中參考相關文獻的報道,同時根據本實驗室儀器的實際情況,分別比較了正負離子下氟蟲腈及其代謝物的響應情況,結果表明,氟蟲腈及其代謝物在負離子模式下具有較強的響應,因其化學結構中都含有的氨基結構,在水溶液環境中,氨基中的N原子上的孤對電子易與外界環境中的H+結合后呈堿性,一般情況下,堿性化合物易在負離子模式下電離,因此,本試驗中選擇負離子模式對氟蟲腈及其代謝物進行測定,同時也對相關的離子對組合和電壓等相關參數進行優化,結果如表2所示。

一般情況下,在正離子模式下,流動相中加入甲酸、乙酸銨等可提高正離子化效率,負離子模式下加入氨水以提高pH可以提高負離子效率[21-22],針對氟蟲腈及其代謝物的化學結構,其在C18色譜柱上的保留較好,采用甲醇-水作為流動相能夠達到較好的分離效果,無拖尾及寬峰現象,而氨水的加入對于氟蟲腈及其代謝物的離子化效率并未明顯增強。因此,本試驗采用負離子模式,選擇甲醇-水作為流動相,且無須在流動相中加入銨鹽或者酸性化合物。因氟蟲腈及其代謝物的極性偏小,故試驗組選擇甲醇的初始梯度為65%,采用梯度洗脫的方式,氟蟲腈及其代謝物得到了較好的分離,峰形較好,結果如圖1所示。

圖1 氟蟲腈及其代謝物標準的提取離子對色譜圖(濃度50 ng/mL)Fig.1 Standard chromatogram of extracted ion pair chromatograms of fipronil and its metabolites(concentration of 50 ng/mL)注:A、B、C和D分別為氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈砜和氟蟲腈亞砜。

表3 氟蟲腈及其代謝物的線性范圍、決定系數(R2)、檢出限和定量限Table 3 Linear ranges,determination coefficients(R2),limits of detection(LODs)and limits of quantitation(LOQs)of fipronil and its metabolites

2.2 氟蟲腈及其代謝物測定方法學考察

2.2.1 線性范圍和靈敏度 將氟蟲腈及其代謝物分別用甲醇稀釋成不同的濃度,分別進樣,進行線性回歸,得到其線性范圍并計算相關系數;同時利用滇紅茶空白樣品基質,分別添加不同濃度的氟蟲腈及其代謝物,通過不斷地降低所添加的氟蟲腈及其代謝物濃度,直至其出峰達到3倍和10倍信噪比(S/N),所對應的加標濃度即為其檢出限和定量限。實驗結果表明,氟蟲腈及其代謝物在0.5～100 μg/mL的濃度范圍內線性關系較好,R2大于0.9991,檢出限為0.4 μg/kg,定量限為1.5 μg/kg。

表4 氟蟲腈及其代謝物的回收率和相對標準偏差 Table 4 Recoveries and relative standard deviations of fipronil and its metabolites

本研究中采用了茶葉凈化專用柱TPT小柱,結合超高效液相色譜-串聯質譜儀,極大地提高了檢測靈敏度,達到了痕量檢測的要求。

2.2.2 回收率和精密度測定 以市場上銷售的滇紅茶作為試驗對象,根據氟蟲腈及其代謝物的定量限,分別以1倍、5倍和10倍定量限作為添加濃度進行加標回收試驗,每個添加濃度做6次平行試驗。結果如表4所示,不同添加濃度下氟蟲腈及其代謝物的回收率范圍為84.4%～95.5%,相對標準偏差范圍為4.8%～7.4%,符合農藥殘留測定的要求。

2.3 滇紅茶加工過程中氟蟲腈及其代謝物降解變化規律

分別對滇紅茶加工過程的每個主要步驟中取樣,進行氟蟲腈及其代謝物的測定,為保證測定結果的一致性和可比性,通過對每個步驟中取樣的含水量進行測定,將測定結果換算并以干樣計算,測定結果如表5所示,通過對各個步驟中的氟蟲腈及其代謝物進行降解折線圖的繪制,結果表明,氟蟲腈及其代謝物的初始含量大致相同,且隨著加工步驟的增多而呈現出含量不斷降低的趨勢,且降解速率類似,經揉捻后的滇紅茶樣品中的氟蟲腈及其代謝物呈現出明顯降低的趨勢,其降解率為37.5%～41.2%,隨后經發酵步驟后的滇紅茶中的氟蟲腈及其代謝物的含量變化較小,而經干燥后的滇紅茶中氟蟲腈及其代謝物的含量又明顯降低,氟蟲腈及其代謝物經過滇紅茶的加工過程后的最終降解率為65.1%～70.1%,初步表明,揉捻和干燥兩個步驟中氟蟲腈及其代謝物能夠大量地降解,推測原因可能為揉捻和干燥兩個步驟中的溫度較高,高溫下易引起氟蟲腈及其代謝物的降解,該結論與李棟等[23-26]所述一致。

表5 滇紅茶加工過程中氟蟲腈及其代謝物含量Table 5 Content of fipronil and its metabolites during processing of black tea

表6 滇紅茶中氟蟲腈及其代謝物膳食評估Table 6 Dietary evaluation of fipronil and its metabolites in black tea

2.4 滇紅茶中氟蟲腈及其代謝物膳食評估

根據HQ和HI的計算公式,以滇紅茶中的氟蟲腈及其代謝物最終含量分別計算相關的危害因子,膳食評估結果如表6所示,氟蟲腈及其代謝物的各HQ值均小于1,表明滇紅茶中氟蟲腈及其代謝物的膳食暴露風險較低;而氟蟲腈及其代謝物的總危害指數HI為2.175,大于1,表明膳食暴露風險不可接受,但是該情況是在較大的施藥量的條件下,即極端條件下的單種農藥的計算值表明膳食暴露風險可接受,同時目前市場上只有氟蟲腈農藥售賣,其余3種為氟蟲腈的代謝物,滇紅茶實際生產中不可能同時違禁使用4種氟蟲腈類化合物。因此,鑒于氟蟲腈及其代謝物已在茶葉中禁止使用,結合滇紅茶中氟蟲腈及其代謝物的HQ和HI值,初步表明其膳食暴露風險較低,但也應引起重視。

3 結論

利用TPT凈化小柱,結合超高效液相色譜-串聯質譜,建立了滇紅茶中氟蟲腈及其代謝物的高靈敏度快速測定方法,在負離子MRM監測模式下,氟蟲腈及其代謝物在0.5～100 μg/mL的濃度范圍內的線性關系較好,最低檢出限為0.4 μg/kg,3個添加濃度下的回收率范圍為84.4%～95.5%,相對標準偏差范圍為4.8%～7.4%,可滿足滇紅茶中痕量氟蟲腈及其代謝物殘留檢測的要求。本研究以滇紅茶為研究對象,通過在茶樹鮮葉上噴灑氟蟲腈及其代謝物后采摘,對滇紅茶加工過程的每個主要步驟中進行取樣并測定氟蟲腈及其代謝物含量,結果表明,氟蟲腈及其代謝物含量在滇紅茶加工過程中隨加工步驟的增多而不斷降低,揉捻和干燥兩個步驟中氟蟲腈及其代謝物能夠大量地降解;根據最終滇紅茶產品中氟蟲腈及其代謝物的含量,計算HQ和HI結果表明,氟蟲腈及其代謝物的各HQ值均小于1,膳食暴露風險較低,而氟蟲腈及其代謝物的總危害指數HI大于1,膳食暴露風險不可接受,但是鑒于氟蟲腈及其代謝物已在茶葉中禁止使用,結合滇紅茶中氟蟲腈及其代謝物的HQ和HI值,初步表明其膳食暴露風險較低。

本研究中所用的危害商HQ主要是基于ADI、平均體重和膳食量進行評估的,主要是基于已有的相關數據和田間試驗的殘留值所得,但是在實際情況中不同消費群體的體重和膳食量有所差異,而所得的危害商可能也略有不同,在今后的研究中,還需要針對不同消費群體進行相應的系統評估,以期得到更加系統全面的評估結論。