藤黃果果實羥基檸檬鉀鹽的提取工藝優化與鑒定

曾 媛,宋雅慧,俞 泉,韓晏麒,金晨鐘,2,王 艷,2,張雪嬌,2,胡一鴻,2,*

(1.湖南人文科技學院農藥無害化應用重點實驗室,湖南婁底 417000; 2.湖南人文科技學院，湖南省農田雜草防控技術與應用協同創新中心,湖南婁底 417000)

藤黃果(GarciniacambogiaL.)是一種廣泛分布于南亞熱帶地區的藤黃科喬木,其果實部分的果皮中富含羥基檸檬酸,果實具有酸味,在南亞國家常被用來作為食物調料和傳統藥物[1-3]。羥基檸檬酸是ATP檸檬酸裂解酶的強競爭性抑制劑,具有抑制脂肪酸合成和促進糖原異生的作用,能夠增高人體對丙酮酸和乳酸的利用率,從而起到抑制食欲的目的。羥基檸檬酸能夠調節肥胖人群的胰島素和血脂水平,并能提升身體中血清內的5-羥基色胺的含量,起到加速身體中能量消耗的作用,而且目前沒有發現適量攝入羥基檸檬酸具有明顯的毒副作用[4-5]。因此,在國內外市場上,羥基檸檬酸常作為減肥功能性食品的有效成分加以應用[6-8]。近年的研究也表明,羥基檸檬酸還能抑制腎內草酸鈣結晶的生成和瓦解泌尿系統的草酸鈣結晶的功效[9]。

羥基檸檬酸是含有2個羥基和3個游離羧基的有機酸,其特定的分子結構使其在常規的分離提取過程中極易自身縮合成內酯,導致提取物的生物學活性喪失,甚至對動物體產生一定的毒副作用[10]。目前工業制備上從藤黃果中提取羥基檸檬酸主要采用3種方法:水提取法[11]、有機溶劑提取法[2]和離子交換層析提取法[12]。國內外市場上的藤黃果提取物主要采用上述3種方法用藤黃果的果皮制備。但藤黃果干燥后,其果皮與果肉很難分離,而且現有工藝制備的藤黃果提取物的主要成分為羥基檸檬酸內酯,而不是游離的羥基檸檬酸[2,13],目前仍未見高效分離提取游離羥基檸檬酸工藝的報道。因此,本試驗以藤黃果果實(全果)為原料,采用水提取法,用KOH保護游離羥基檸檬酸以制備羥基檸檬酸鉀鹽,以料液比、濃縮倍數、酒精度數、pH為考察因素,獲取游離羥基檸檬酸鹽的最佳制備方法,并對提取的羥基檸檬酸進行定性與定量檢測,以期為優化工業化生產羥基檸檬酸提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藤黃果果實(全果) 貴州黎平博遠生態農業科技有限公司;羥基檸檬酸標準品 購自ChromaDex公司(色譜純);藤黃果提取物 購自NowFoods公司;偏礬酸銨 購自南京試劑公司;硫酸鈉 購自國藥集團;其他試劑 均為國產分析純。

40～70%vol酒精度計 河北武強華鵬儀器廠;N-1100V-WB旋轉蒸發儀 東京理化器械株式會社;L535R低速冷凍離心機 湖南湘儀;LC-10Avp plus高效液相色譜儀、AUW120D精密分析天平 日本島津;MLS-3750全自動蒸汽滅菌鍋 日本三洋。

1.2 實驗方法

1.2.1 羥基檸檬酸提取 參照Lewis[14]的方法加以改進。自然風干藤黃果果實后,取粉碎至40目的藤黃果果實粉末25 g,加入蒸餾水混勻,于115 ℃高壓蒸煮15 min,冷卻后用5層醫用紗布過濾擠壓出濾液,濾液于4000×g離心15 min,55 ℃減壓蒸發濃縮上清液,然后在濃縮液中按1∶1 (v/v)加入95%乙醇沉淀果膠,雙層紗布過濾后濾液4000×g離心15 min除去果膠沉淀,上清液中加入95%乙醇用40～70%vol酒精度計在室溫下調節溶液酒精度數至額定值,然后加入40% KOH調節pH,形成油狀沉淀后棄上清液,沉淀用95%乙醇洗滌3次,再用無水乙醇洗滌沉淀2次后置于常溫下過夜,然后于60 ℃下減壓蒸發,干燥后稱重。

1.2.2 單因素實驗

1.2.2.1 料液比對羥基檸檬酸得率的影響 分別取25 g藤黃果果實粉末,固定濃縮倍數為5倍、酒精度數為60%vol、pH為10,分別在料液比為1∶10、1∶14、1∶18、1∶22的條件下,測定羥基檸檬酸得率。

1.2.2.2 濃縮倍數對羥基檸檬酸得率的影響 分別取25 g藤黃果果實粉末,固定料液比為1∶10、酒精度數為60%vol、pH為10,分別在濃縮倍數為1、3、5、7的條件下,測定羥基檸檬酸得率。

1.2.2.3 酒精度數對羥基檸檬酸得率的影響 分別取25 g藤黃果果實粉末,固定料液比為1∶10、濃縮倍數5倍,pH為10,分別在酒精度數為40、50、60、70%vol的條件下,測定羥基檸檬酸得率。

1.2.2.4 pH對羥基檸檬酸得率的影響 分別取25 g藤黃果果實粉末,固定料液比為1∶10,濃縮5倍,酒精度數60%vol,分別在pH為9、10、11、12的條件下,測定羥基檸檬酸得率。

1.2.3 正交試驗 通過單因素實驗,選取液料比、濃縮倍數、酒精度數、pH為考察因素,以羥基檸檬酸得率為考察指標,設計4因素3水平正交試驗優化工藝條件,因素水平表見表1。

1.2.4 羥基檸檬酸得率 羥基檸檬酸得率按如下公式計算:

式(1)

1.2.5 藤黃果果實羥基檸檬酸的鑒定與定量分析 將提取的樣品、羥基檸檬酸標準品和NowFoods公司的藤黃果提取物進行顯色反應、薄層層析的初步鑒定,高效液相色譜定量分析,判定本試驗提取的樣品。

1.2.5.1 顯色反應 顯色反應參照Bainto等[15]的方法。稱取0.1 g待測樣品溶于50 mL 3.0%的磷酸溶液中,40 KHz、0.5 W/cm2超聲波處理30 min后取1 mL上清液,加入3 mL 1%偏礬酸銨,靜置30 min后點樣置于白色搪瓷片上觀察。

1.2.5.2 薄層層析檢測 取0.1 g待測樣品溶于0.9 mL 3.0%的磷酸溶液中,40 KHz、0.5 W/cm2超聲波處理30 min后用0. 45 μm水性微孔濾膜過濾,點樣在活化后的GF254薄層層析硅膠板(2.5×7.5 cm)上,以甲醇∶水=6∶1 (v/v)為展開劑。層析完畢后采用5%偏礬酸銨溶液顯色。Rf值按如下公式計算:

式(2)

1.2.5.3 高效液相色譜檢測 參照惠戰鋒等[16]的方法。采用LC-10Avp plus高效液相色譜儀檢測,色譜柱為Wondasil C18(250 mm×4.6 mm,5 μm),流動相為0.05 mol/L硫酸鈉,用硫酸調整pH至2.3,流速為1 mL/min。取50 mg待測樣品溶于40 mL 3.0%的磷酸溶液中,超聲波處理30 min后用0. 45 μm水性微孔濾膜過濾,每次上樣量為20 μL,采用紫外檢測器于210 nm處檢測,采用0.01～0.20 mg/mL的色譜純羥基檸檬酸繪制外標曲線進行純度測算。

1.3 數據處理

進行3次單因素實驗的平行實驗,并在正交試驗獲取的最優條件下進行3次平行實驗驗證結果。采用SPSS 19.0進行差異顯著性比較(P<0.05)(LSD法),結果以平均值±標準誤差(M±SE),用小寫字母標注顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 料液比對羥基檸檬酸得率的影響 由圖1可知,隨著料液比的增大得率先增大后減小。當料液比為1∶14時,羥基檸檬酸得率達到最大,為2.04%,隨后隨料液比的增大得率緩慢下降。在一定范圍內,當料液比增大,浸提的水分子則能與浸提物充分接觸,提高親水的羥基檸檬酸的得率。但當料液比繼續增大,浸出的效率達到峰值后,由于浸出物的濃度隨溶劑的體積而稀釋,會造成浸出物不穩定,同時減壓蒸發濃縮時間也會相應增長,過長的加熱會使羥基檸檬酸形成內脂[17],也會造成得率下降。因此,采用料液比1∶14。

圖1 不同料液比對羥基檸檬酸得率的影響Fig.1 Effects of different solid liquid ratios on recoveryrate of hydroxycitric acid from G. cambogia L.注:用小寫字母標注顯著性差異(P<0.05);圖2～圖4同。

2.1.2 不同濃縮倍數對羥基檸檬酸得率的影響 由圖2可知,隨著濃縮倍數的增大得率先增大后減小。當濃縮倍數為5倍時,得率為1.58%。當濃縮倍數達到7倍時,得率顯著下降(P<0.05),僅為0.46%。由于濃縮過程是在55 ℃的溫度下進行,設定濃縮倍數過高時,長時間的高溫使得羥基檸檬酸容易形成內脂,降低了得率。因此,采用濃縮倍數為5倍。

圖2 不同濃縮倍數對羥基檸檬酸得率的影響Fig.2 Effects of different condensive folds on recoveryrate of hydroxycitric acid from G. cambogia L.

2.1.3 不同酒精度數對羥基檸檬酸得率的影響 由圖3可知,隨著酒精度數的增加得率先增大后減小。當酒精度數達到60%vol時,得率達到最大值,為1.18%。隨著酒精度數的繼續增大,得率開始下降。采用乙醇使羥基檸檬酸沉淀是在溶液的一定極性范圍之內的,通過加入乙醇調整溶液的極性而產生沉淀。當溶液的酒精度數達到60%vol時,羥基檸檬酸的溶解度達到最低,充分沉淀出來。因此,采用酒精度數為60%vol。

圖3 不同酒精度數對羥基檸檬酸得率的影響Fig.3 Effects of different alcohol degrees on recoveryrate of hydroxycitric acid from G. cambogia

2.1.4 不同pH對羥基檸檬酸得率的影響 由圖4可知,隨著pH的增加得率先增大后減小,當pH為11時,得率達到最大值,為1.56%。羥基檸檬酸為弱酸,在堿性條件下能形成鹽。但堿性條件偏大時,過高濃度的OH-離子可能會破壞羥基檸檬酸鹽的穩定性,溶液極性的改變會導致乙醇沉淀效率下降[14,18]。因此,采用pH為11。

圖4 不同pH對羥基檸檬酸得率的影響Fig.4 Effects of different pH on recovery rate ofhydroxycitric acid from G. cambogia

2.2 正交試驗結果分析

在單因素實驗的基礎上,選取液料比、濃縮倍數、酒精度數、pH進行4因素3水平的正交試驗,以獲取最佳提取條件。

正交試驗結果見表2。通過表2直觀分析顯示,理論最佳提取條件為:A3B2C2D3,即料液比為1∶18、濃縮為5倍、酒精度數為60%vol、pH為12。影響藤黃果羥基檸檬酸提取效果的因素大小順序依次為A(液料比)>B(濃縮倍數)>D(pH)>C(酒精度數)。在此優化提取條件下進行3次驗證實驗,得率為3.24%±0.32%,高于表2試驗組合中的最高值,說明正交試驗結果合理。

表2 正交試驗結果Table 2 Results of orthogonal test

以極差值最小的C因素為誤差列[19],正交試驗結果進行方差分析和F檢驗,發現料液比相對于得率存在顯著性差異(P<0.05),而濃縮倍數、酒精度數、pH對得率的影響并不顯著(P>0.05)(表3)。

表3 正交試驗方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal test results

2.3 顯色反應與薄層層析

用偏礬酸銨進行顯色反應,發現羥基檸檬酸標準品、藤黃果果實羥基檸檬酸和Now Foods藤黃果提取物均呈紅棕色,而檸檬酸呈淡黃色(圖5)。薄層層析的結果顯示,羥基檸檬酸標準品、檸檬酸、藤黃果果實羥基檸檬酸和Now Foods藤黃果提取物的Rf值無明顯差異,均在0.69～0.71之間,但檸檬酸的Rf值稍低(圖6)。說明顯色反應和薄層層析能夠定性鑒定羥基檸檬酸和與其結構相似的檸檬酸。

圖5 偏礬酸銨顯色反應檢測羥基檸檬酸Fig.5 Chromogenic reaction with ammoniummonovanadate analysis of hydroxycitric acid注:1:檸檬酸;2:羥基檸檬酸標準品;3:藤黃果果實羥基檸檬酸;4:NowFoods藤黃果提取物。

圖6 薄層層析分析檢測羥基檸檬酸Fig.6 Thin layer chromatographic analysis of hydroxycitric acid注:1:羥基檸檬酸標準品;2:檸檬酸;3:藤黃果果實羥基檸檬酸;4:NowFoods藤黃果提取物。

2.4 高效液相色譜檢測

將提取的樣品進行高效液相色譜檢測,發現在保留時間2.90 min處出現吸收峰,與羥基檸檬酸標準品(2.96 min)和NowFoods公司的藤黃果提取物(2.88 min)保留時間一致,但NowFoods公司的藤黃果提取物在5.63 min處還有1個更強的雜質峰(圖7),可判定本試驗提取的樣品為藤黃果果實羥基檸檬酸。經3次重復,外標法測得藤黃果果實羥基檸檬酸的純度為52.10%±0.53%,NowFoods公司的藤黃果提取物羥基檸檬酸的純度為34.42%±0.48%。

圖7 高效液相色譜檢測羥基檸檬酸Fig.7 HPLC analysis of hydroxycitric acid注:a:羥基檸檬酸標準品;b:藤黃果果實羥基檸檬酸;c:NowFoods藤黃果提取物。

3 結論

本試驗在單因素實驗的基礎上,通過正交試驗及方差分析,得到了水提取法提取藤黃果果實羥基檸檬酸的最佳條件為料液比為1∶18、濃縮為5倍、酒精度數為60%vol、pH為12。在該試驗條件下,羥基檸檬酸的得率為3.24%±0.32%。該方法采用KOH在偏堿性條件下保護了游離羥基檸檬酸,提取物色譜檢測為單峰,說明不含羥基檸檬酸內酯,現有工藝的提取產物主要為羥基檸檬酸內酯,在常溫下羥基檸檬酸內酯與羥基檸檬酸的比例高達9∶1[2],而最終產品中的羥基檸檬酸內酯殘留可能對人體產生毒副作用[10,20]。采用偏礬酸銨顯色和薄層層析對羥基檸檬酸進行了初步鑒定,采用高效液相色譜法測定藤黃果果實羥基檸檬酸的純度為52.10%±0.53%。本試驗工藝參數對現有藤黃果羥基酸制備工藝的改進具有較強的參考價值。