響應面分析法優化魚露揮發性風味物質萃取工藝

陳麗麗,白春清,袁美蘭,江 勇,趙 利,*

(1.江西科技師范大學生命科學學院,江西南昌 330013; 2.國家淡水魚加工技術研發分中心,江西南昌 330013)

魚露是一種高營養的水產調味品,是一種清澈的棕色液體,味道鮮美。魚露主要以低價值的魚、蝦及其加工的副產物為原料,與一定比例的食鹽混合,利用原料自身的內源性酶和多種微生物之間的共同作用,通過分解和發酵原料中的脂肪、蛋白質和其它成分制成的液體調味品[1]。魚露具有魚蝦等水產品原料特有的風味,是東亞及東南亞各國必需的日常調味料,也是這些地區居民膳食中主要蛋白質的來源之一[2]。

人類雖然很早就開始食用魚露,但對魚露的風味物質卻并不是完全了解,國外對魚露的研究主要集中在風味和微生物方面[3-6]。近年來隨著對魚露的進一步研究,關于魚露呈味方面的報道層出不窮,對于魚露風味已經有了一部分的了解。魚露風味組成相當復雜,Katsuya等[7]通過炙烤香、魚腥味、氨味、酸敗味、奶酪香、肉香來描述魚露的特征性風味;Pham等[8]通過魚腥味、奶酪味、黃油爆米花味和熟米飯味來描述魚露的特征性風味;Giri等[9]認為魚露的主要特征氣味是堅果味、奶酪味、氨味、魚腥味,其中氨、胺類等構成氨味。Shimoda等[10]對魚露進行堿化處理,提高了魚露中含氮和含硫化合物的釋放,采用GC-MS分析法對魚露的揮發性物質進行檢測,初步鑒定了124種化合物,堿化后對三甲胺、二甲基二硫等不易被現有方法檢測到的高揮發性含氮含硫化合物檢測得到了加強。Yimdee等[6]采用氣相色譜-質譜-嗅聞技術(GC-MS-O)對14種魚露中的揮發性化合物進行檢測,共檢定了79種化合物。揮發性成分是調味品中主要的商業元素,雖然占比較小,但卻是區別兩種食品的一個重要質量特征,是衡量食品品質的重要因素[11]。作為調味品,風味的研究對提高魚露的質量和品質具有重要的指導意義[12]。魚露是發酵產品,其發酵過程是以其原料中的蛋白質、脂質和糖類等營養物質為基礎,在微生物和酶的作用下發生以營養物質分解為主體的一系列復雜代謝活動,逐漸產生醇、酯、醛、酮等化合物[13-14],最終才有了魚露獨特的風味。

目前有許多關于魚露的營養成分的研究,但對于魚露的風味成分卻并不是完全了解。全二維氣相色譜質譜具有較高的分離度和分辨度,其峰容量相當于兩個色譜柱各自峰容量的乘積,適用于復雜樣品的分析,根據不同的樣品類型以及不同的分離效率和分類特征(官能團、極性、沸點等),選擇不同的二維柱系統,因此極大地提高了光譜峰值分析的準確度。本文建立使用的HS-SPME-GC×GC-MS聯用能較好地分析測定魚露揮發性風味物質的相對百分比,更好的對樣品中的成分進行分離,分辨率高。此方法方便、快捷且效率高,測定結果真實且較為全面地反映銀魚魚露中揮發性物質的組成,可以為魚露產品的品質檢測提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

銀魚魚露 青島正道食品有限公司;混合正構烷烴標準溶液 美國Restek公司;2,4,6-三甲基吡啶標準品 美國Afla Aesar公司;氯化鈉 上海麥克林生化客家有限公司。

AOC-5000頂空-固相微萃取三合一自動進樣器 瑞士CTC公司;65 μm P DMS/DVB固相微萃取頭萃取頭 美國Supelco公司;GCMS-TQ8050三重四極桿型氣質聯用儀 日本島津公司;20 mm聚四氟乙烯磁性蓋頭 德國CNW公司;20 mL頂空瓶 美國Altech公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 魚露風味物質的萃取 向20 mL的頂空瓶中加入5 mL魚露樣品和5 g NaCl,振搖1 min,使其達到過飽和,加入10 μL濃度為0.05 mg/L的標準品2,4,6-三甲基吡啶,然后用聚四氟乙烯磁性蓋頭迅速密封,置于自動進樣器中。萃取頭(250 ℃活化30 min)頂空吸附20 min后,迅速將萃取頭插入氣相色譜進樣口解吸5 min,然后進行GC×GC-MS分析,每組樣品分別測5個平行樣品。

1.2.2 單因素實驗 將HS-SPME-GC×GC-MS檢測魚露時設定的參數作為單因素,包括萃取溫度、萃取時間和振蕩頻率。取市售銀魚魚露進行單因素實驗。每個條件做三次平行試驗。

1.2.2.1 萃取時間的優化 取5 mL魚露樣品按照上述樣品處理方法預處理后放入20 mL頂空瓶中進行風味成分的萃取,固定萃取溫度為50 ℃、振蕩頻率500 r/min保持不變,萃取時間設定按照30、40、50、60、70和80 min,進行樣品風味物質測定來優化萃取時間。

1.2.2.2 萃取溫度的優化 取5 mL魚露樣品按照上述樣品處理方法預處理后放入20 mL頂空瓶中進行風味成分的萃取,固定萃取時間60 min、振蕩頻率500 r/min保持不變,萃取溫度設定按照40、45、50、55、60、65和70 ℃,進行樣品風味物質測定來優化萃取溫度。

1.2.2.3 振蕩頻率的優化 取5 mL魚露樣品按照上述樣品處理方法預處理后放入20 mL頂空瓶中進行風味成分的萃取,固定萃取時間為60 min、萃取溫度50 ℃保持不變,振蕩頻率設定按照300、400、500、600和700 r/min,進行樣品風味物質測定來優化振蕩頻率。

1.2.3 Box-Behnken響應面法優化 根據單因素實驗,對萃取溫度、萃取時間和振蕩頻率三個因素的試驗結果進行分析,根據揮發性物質的總個數和總體積來確定較優的萃取條件,采用Design Expert 8.0.6軟件設計三因素三水平響應面試驗方案,響應面分析因素和水平見表1,得到魚露風味物質固相微萃取的最佳工藝,在最佳工藝的條件下進行魚露風味物質的測定。

表1 SPME萃取實驗因素水平編碼Table 1 SPME extraction experimental factors level coding

1.2.4 檢測分析 參考文獻[15]的方法操作。

1.2.4.1 色譜條件 色譜柱一:聚乙二醇(PEG)毛細色譜柱HP-INNOWax(30 m×0.25 mm,0.25 μm);色譜柱二:ID-BPX1毛細色譜柱(10 m×0.1 mm,0.1 μm)。載氣為He(99.999%);柱前壓為285.7 kPa;柱箱溫度為50 ℃;進樣口溫度為250 ℃;不分流進樣;流速為1 mL/min;進樣時間1 min;程序升溫:起始溫度為50 ℃,保持2 min,然后以2 ℃/min的速度升到250 ℃,保持10 min。

1.2.4.2 質譜條件 離子化方式為電子轟擊(electron impactionization,EI),離子源溫度為200 ℃,接口溫度為250 ℃,電子能量為70 eV;不分流進樣;溶劑延遲1.5 min后采集信號;檢測模式為全掃描,掃描質量范圍(m/z)45～330。

1.3 數據處理

試驗結果采用平均值±標準差(Mean±SD)表示,每個試驗平行4次。采用SPSS對試驗數據進行差異性分析(ANOVA)檢查各個結果的顯著性差異,同時采用Excel 2010進行數據作圖處理。響應面試驗采用Design-Expert 8.0.6進行結果分析處理。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 萃取時間對萃取效果的影響 由圖1可知,出峰個數和峰體積隨著萃取時間的延長呈先升高后下降的趨勢,在30～40 min內,隨著時間的增加,峰體積和出峰個數增加,40～50 min這段時間,峰體積和出峰個數呈下降趨勢,在60 min時,峰體積達到最高值7.55×1010,出峰個數在70 min時達到最高1346個。隨著萃取時間的延長,頂空瓶中揮發性物質的濃度升高,萃取頭不斷吸附頂空瓶中的揮發性成分,所以檢測到的出峰個數和峰體積不斷升高。隨著萃取時間的進一步延長,檢測到的出峰個數和峰體積有所下降,這表明萃取時間過長并不一定有效。萃取一段時間后,萃取頭達到飽和狀態,如果時間延長,可能導致揮發性氣體溢出,檢測到的揮發性物質成分將減少[16]。綜合考慮,最終選取60 min作為最佳萃取時間。

圖1 萃取時間對萃取效果的影響Fig.1 Effect of extraction time on extraction

2.1.2 萃取溫度對萃取效果的影響 由圖2可知,在萃取過程中隨著萃取溫度的升高,出峰個數和峰體積呈現一種先增加后下降的趨勢。在40～45 ℃時,萃取的揮發性化合物峰體積和出峰個數增加,50～60 ℃溫度范圍內,隨著溫度的升高,峰體積和出峰個數也隨著增加,當溫度達到60 ℃時,出峰個數1663個和峰體積9.94×1010達到了最高值,這是由于頂空瓶中揮發性物質的濃度升高,被萃取頭吸附的揮發性成分含量更高,所以檢測到的出峰個數和峰體積也在升高。隨著萃取溫度的繼續升高,萃取的揮發性化合物的峰體積和出峰個數呈下降趨勢。當溫度繼續升高到70～80 ℃時,樣品中的一些揮發性成分遭到破壞,檢測得到的出峰個數和體積下降。萃取溫度對揮發性物質的吸附有一定的影響,溫度過低,沸點低的化合物不能揮發出來,但溫度過高,一些化合物可能會分解和變性,同時萃取頭分析揮發性化合物組分的能力將降低[17]。綜合來看,選取60 ℃作為最適宜的萃取溫度。

圖2 萃取溫度對萃取效果的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on extraction

2.1.3 振蕩頻率對萃取效果的影響 由圖3可知,振蕩頻率對出峰個數和峰體積也有一定的影響。隨著振蕩頻率的增加,出峰個數和峰體積呈現先上升后下降的趨勢,在300～500 r/min振蕩頻率內,萃取的揮發性化合物隨著振蕩頻率的增加峰體積和出峰個數增加,在500 r/min振蕩頻率,峰體積和出峰個數達到了最大1663個和9.94×1010,隨著振蕩頻率的繼續增加,出峰個數和峰體積明顯減少。SPME采用的是纖維振蕩的方式,可以精確控制振蕩頻率,提高分析的重復性。纖維頭的振蕩促進樣品均勻化,從而液體樣品連續產生新的液位,并加速了分析物從樣品到頂部空間,然后從頂部空間到纖維頭的傳質過程[18]。綜上所述,500 r/min振蕩頻率萃取效果最好,在此振蕩頻率下萃取的揮發性風味物質最多。

圖3 振蕩頻率對萃取效果的影響Fig.3 Effect of oscillation frequency on extraction

2.2 Box-Behnken響應面法優化萃取魚露風味物質的工藝

在單因素實驗的基礎上,對萃取時間、萃取溫度和振蕩頻率進行結果分析,分別選取最佳的萃取條件,響應面分析法試驗結果見表2和表3。

2.2.1 萃取魚露風味響應面實驗設計及方差分析 采用Design-Expert 8.0.6對表2出峰個數結果進行多元擬合回歸分析,表3為出峰個數的方差分析結果。以出峰個數為響應值對應自變量萃取溫度、萃取時間和振蕩頻率進行橫量型擬合,得到二次響應面回歸模型方程為:出峰個數Y1=1541.2-8.625A+21.625B+22C-28.75AB+49.5AC+18BC-42.975A2-13.475B2-59.725C2,該模型失擬項P值大于0.05,回歸項P值小于0.01,R2=0.9217,說明該模型與試驗擬合良好,可用于理論推測對萃取效果的判定。

采用Design-Expert 8.0.6對表2、表4峰體積進行多元擬合回歸分析,得到峰體積的二次響應面回歸模型方差分析,峰體積(×1010)Y2=7.366-0.06625A+0.24375B+0.42C-0.33AB+0.6375AC-0.0575BC-0.268A2-0.173B2-0.5505C2,失擬項P值大于0.05,回歸項P值小于0.01,R2=0.9185,說明該模型與試驗擬合良好。

表3 出峰個數的響應面二次模型方差分析Table 3 Analysis of the variance of the response surface quadratic model of the number of peaks

通過對出峰個數和峰體積進行響應面二次模型方差分析,振蕩頻率和萃取時間對萃取效果的影響顯著(P<0.05),萃取溫度對萃取效果的影響不顯著(P>0.05),在交互項中萃取溫度/振蕩頻率對萃取效果的影響極顯著(P<0.01),萃取時間/振蕩頻率對萃取效果的影響不顯著(P>0.05)。由此可知,樣品的出峰個數和峰體積與萃取溫度、萃取時間和振蕩頻率之間有明顯的線性關系,各個因素對魚露揮發性化合物萃取效果影響主次因素為振蕩頻率>萃取時間>萃取溫度。

表2 Box-Behnken響應面實驗設計及結果Table 2 Experimental design and results ofBox-Behnken response surface

2.2.2 萃取魚露風味響應面交互作用分析 對響應面結果進行方差和顯著性檢驗后,依據二次多項方差擬合結果,確定其中一個因子,并繪制Y和另外兩個因子的三維響應曲面圖和等高線圖,最佳參數和每個參數之間的相互作用可以從響應面分析圖中直觀地看到[19]。當特征值為正值時,響應分析圖為具有最小值的山谷形曲面。當特征值為負時,它是一個具有最大值的山丘曲面。當特征值具有正值和負值時,它們是鞍形曲面,并且無極值存在[20]。根據響應曲面和等高線圖,分析萃取溫度、萃取時間以及振蕩頻率對萃取效果的影響,結果如圖4～圖9所示。

表4 峰體積的響應面二次模型方差分析Table 4 Analysis of the variance of the response surface quadratic model of the volume of peaks

圖4 萃取時間和萃取溫度對出峰個數影響的響應曲面和等高線圖Fig.4 Response surface and contour plots of extraction time and extraction temperature on the number of peaks

圖5 振蕩頻率和萃取溫度對出峰個數影響的響應曲面和等高線圖Fig.5 Response surface and contour map of the influence of oscillation frequency and extraction temperature on the number of peaks

圖6 振蕩頻率和萃取時間對出峰個數影響的響應曲面和等高線圖Fig.6 Response surface and contour map of the influence of oscillation frequency and extraction time on the number of peaks

圖7 萃取溫度和萃取時間對峰體積影響的響應曲面和等高線圖Fig.7 Response surface and contour plots of extraction temperature and extraction time on peak volume

當固定振蕩頻率不變時,隨著萃取時間和萃取溫度的增加,出峰個數逐漸增加,萃取時間增加的更顯著一些,且等高線呈現橢圓形,表明萃取時間和萃取溫度兩個因素的交互作用比較明顯;當固定萃取時間不變,隨著振蕩頻率和萃取溫度的增加,出峰個數呈現先增加后下降的趨勢,且等高線呈現橢圓形,橢圓效果最明顯,表明振蕩頻率和萃取溫度兩個因素的交互作用比較明顯;當固定萃取溫度不變時,隨著振蕩頻率和萃取時間的增加,峰體積呈現先增加后下降的趨勢,且等高線呈現橢圓形,表明振蕩頻率和萃取時間兩個因素的交互作用比較明顯。

圖8 萃取溫度和振蕩頻率對峰體積影響的響應曲面和等高線圖Fig.8 Response surface and contour plot of the influence of extraction temperature and oscillation frequency on peak volume

圖9 萃取時間和振蕩頻率對峰體積影響的響應曲面和等高線圖Fig.9 Response surface and contour plots of extraction time and oscillation frequency versus peak volume

當固定振蕩頻率不變時,隨著萃取時間和萃取溫度的增加,峰體積逐漸增加,萃取時間增加的更明顯一些,且等高線呈現橢圓形,表明萃取時間和萃取溫度兩個因素的交互作用比較明顯;當固定萃取時間不變,隨著振蕩頻率和萃取溫度的增加,峰體積下降的趨勢,萃取溫度下降更明顯,且等高線呈現橢圓形,表明振蕩頻率和萃取溫度兩個因素的交互作用比較明顯;當固定萃取溫度不變時,隨著振蕩頻率和萃取時間的增加,峰體積呈現先增加后下降的趨勢,且等高線呈現橢圓形,表明振蕩頻率和萃取時間兩個因素的交互作用比較明顯。

通過Design-Expert 8.0.6和綜合考慮分析,魚露風味物質成分萃取的最佳條件為:萃取溫度58 ℃,萃取時間70 min,振蕩頻率510 r/min,該模型在此條件下，預測的出峰個數最多,為1558.55個,峰體積為7.56×1010。

2.3 魚露揮發性風味物質檢測結果

2.3.1 HS-SPME-GC×GC-MS對銀魚魚露揮發性風味成分的分離效果 魚露的風味組成成分十分復雜,傳統的一維色譜由于分離分析能力有限,不能將其完全分離開來。采用全二維正交分離系統對魚露揮發性風味成分進行分離,得到分離3D圖結果如10所示。與一維色譜相比,具有分離度好、峰容量大、雜質干擾較小等特點[21]。全二維氣相色譜具有較高的分離度和分辨度,其峰容量相當于兩個色譜柱各自峰容量的乘積,適用于復雜樣品的分析,根據不同的樣品類型以及不同的分離和分類特征(官能團、極性、沸點等),選擇不同的二維柱系統,因此極大地提高了光譜峰值分析的準確度[22]。在一維色譜上得不到很好地分離、分析的物質,在二維色譜上得到了很好地定性定量分析,二維色譜可以更好地對化合物進行定性定量分析。

圖10 全二維氣相對銀魚魚露揮發性風味成分分離3D圖Fig.10 3D map of volatile flavor components of fulltwo-dimensional gas relative to silver fish fish sauce

表5 銀魚魚露中各類揮發性風味物質的數量和含量Table 5 Quantity and contents of various volatileflavor substances in silver fish sauce

2.3.2 銀魚魚露揮發性風味物質種類分析 表5為銀魚魚露中各類揮發性風味物質的數量和含量。根據上述響應面分析得到的最佳萃取條件,進行魚露揮發性風味物質成分的萃取,全二維氣相色譜進行檢測,共檢測出152種揮發性化合物物質,其中酮類11種,占1.76%;醇類26種,占26.02%;醛類6種,占5.16%;酯類20種,占10.51%;酚類6種,占1.27%;酸類19種,占11.81%;雜環11種,占2.40%;苯環18種,占2.72%;烴類14種,占25.91%;其他未分類的21種,占12.44%。其中種類最多的是醇類和酯類化合物,但含量最多的是醇類和烴類化合物。醇類揮發性物質是脂肪酸二級氫過氧化物的分解、脂質氧化酶對脂肪酸的作用、脂肪的氧化分解生成,或由羰基化合物還原生成醇[23],大多呈香甜的果香,但閾值分布范圍較大。酯類揮發性物質是魚露在發酵過程中脂質代謝產物而生成的醇和羧酸的酯化作用而形成[24],多呈果香和花香味,且閾值較低,能賦予魚露甜香、水果香、花香[25-26]。酮類揮發性物質與多不飽和脂肪酸的熱氧化或降解、氨基酸降解等有關[23],具有花香和果香味,且閾值高,對食品的整體甜花香和果香風味有增強作用[27]。醇類化合物、酯類化合物、酮類化合物可能構成了魚露風味中“肉味”,或者對其他風味有協同作用。醛類揮發性物質是多不飽和脂肪酸在微生物和酶的作用下氧化降解產生醛類物質是魚露揮發性風味化合物的主要組成成分,酸類揮發性物質是由脂肪的水解以及脂肪氧化過程中產生,大多帶有腐敗、汗味或令人作嘔的不愉快氣味,閾值較高,對魚露整體風味有不良影響[28]。雜環類揮發性物質形成原因較為復雜,但此類揮發性物質閾值較低,是食品的特征風味的重要組成,烴類揮發性物質是脂肪酸氧化自由基的均裂所致[29],大多帶清香和香甜味,閾值和含量均較低,對魚露的風味貢獻不大[30],苯環類揮發性物質形成原因較為復雜,但此類揮發性物質閾值較低,是食品的特征風味的重要組成。

3 結論

本試驗采用HS-SPME萃取魚露的揮發性風味物質,通過單因素實驗和響應面優化分析,確定魚露揮發性風味物質的最佳萃取條件:萃取溫度58 ℃,萃取時間70 min,振蕩頻率510 r/min,在此條件下萃取效果最好,預測得到的出峰個數最多,為1558.55個,峰體積為7.56×1010。對銀魚魚露中的揮發性風味化合物的測定,共檢測到152種化合物,可分為酮類、醇類、醛類、酯類、酚類、酸類、雜環、苯環、烴類等,其中化合物種類最多的是醇類和酯類,分別占檢測到26種和20種,但測得化合物含量最多的是醇類和烴類,分別為26.02%和25.91%。

建立使用的HS-SPME-GC×GC-MS聯用能較好地分析測定魚露揮發性風味物質的相對百分比,更好地對樣品中的成分進行分離,分辨率高。此方法方便、快捷且效率高,測定結果真實且較為全面地反映銀魚魚露中揮發性物質的組成,可以為魚露產品的品質檢測提供理論參考。魚露揮發性風味的構成非常龐大與復雜,其中仍然可能存在具備特征風味的單體物質未被發現,且各種揮發性物質之間是否存在協同作用也還未十分明確。