雙水相體系萃取分離鮑魚內臟中的β-葡萄糖苷酶

曾 穎,張亞楠,曾 臻,陳仲巍,余莉莉,吳娟英

(廈門醫學院,福建廈門 361023)

雙水相萃取技術(aqueous two-phase extraction,ATPE)因其操作簡單、條件溫和、易于連續操作與擴大等特點成為近年來被廣泛關注和應用的新型分離技術,且由于其系統中高達70%～80%的含水量能保護和穩定生物活性物質在分離過程中不變性和失活的這一優勢[1-3],更使其能在如酶[4]、蛋白質[5]、病毒[6]、核酸[7]等生物產品[8]和天然產物[9]的提取與分離中被廣泛應用。β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase,CE3.2.1.21)是一種能催化水解芳基和烴基與糖基原子團之間的糖苷鍵生成葡萄糖的酶,該酶對水解纖維素及合成紅景天苷有重要的作用。目前關于β-葡萄糖苷酶的研究主要集中在微生物[10],也有部分植物、動物和水生生物[11],提取純化方法常采用超聲波[12-13]、透析[14]、柱層析[15]等常規方法為主。有研究發現,鮑魚內臟中含有多種消化酶[16-17],其中就含有豐富的β-葡萄糖苷酶[18-19]。鮑魚的加工和食用主要以腹足為主,而占其總重30%左右的臟器大部分被丟棄,為提升鮑魚內臟的應用價值,將其變廢為寶,本研究選用鮑魚內臟為原料,探索從鮑魚內臟中萃取分離β-葡萄糖苷酶效果最佳的PEG/鹽雙水相體系構成,同時采用正交試驗方法對其進行優化,并探究體系pH、樣品加入量、超聲波輔助等影響因素對萃取效果的影響,從而獲得一條雙水相體系分離提取鮑魚內臟中β-葡萄糖苷酶的創新型分離提取技術路線,為目前雙水相萃取技術的應用提供思路啟發。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

皺紋盤鮑內臟 廈門大學海洋與地球學院提供,-20 ℃下冷凍儲藏待用;對硝基苯基-β-D-葡萄糖苷(p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside,p-NPG) 北京索萊寶科技有限公司;對硝基苯酚、碳酸鈉、磷酸二氫鈉(NaH2PO4)、檸檬酸、乙酸、乙酸鈉、氫氧化鈉(均為分析純)、聚乙二醇(Polyethylene glycol,PEG)600、1000、1500、2000、4000 國藥集團化學試劑有限公司。

A25乳化機 上海歐河;Scientz-ⅡD超聲波細胞破碎機 寧波新芝生物科技有限公司;3-18K高速冷凍離心機 德國Sigma;AF100制冰機 意大利斯科茨曼;Epoch 2酶標儀 美國Bio Tek。

1.2 實驗方法

1.2.1 鮑魚內臟的預處理 取一定質量的鮑魚內臟,以1∶4的質量比加入預冷的乙酸-乙酸鈉緩沖液(0.1 mol/L,pH=5.0)[18],在冰浴中用組織搗碎機勻漿后,冰浴浸提1 h后,用高速冷凍離心機離心(10000 r/min,4 ℃,15 min),取上清液(粗酶液)待用。

1.2.2 雙水相體系的構建與優化

1.2.2.1 雙水相體系中鹽種類的確定 取4支15 mL的刻度離心管,分別加入2.5 g 40% PEG1500原液,2 g不同的鹽粉末(磷酸二氫鈉、硫酸銨、磷酸氫二鉀、檸檬酸三鈉)及1 g的粗酶液后,加水補至體系總質量為10 g,使雙水相體系PEG1500的質量分數為10%,鹽的質量分數為20%。充分搖勻溶解后,4 ℃下5000 r/min離心3 min,體系分相后記錄上下相體積,分別取100 μL上相與下相液體,測定其酶活力和蛋白含量。

1.2.2.2 PEG/NaH2PO4相圖的繪制 分別將不同分子量的PEG(600、1000、1500、2000、4000)與NaH2PO4制成一定質量分數的原液,根據參考文獻[20]的方法,對不同分子量PEG/NaH2PO4體系選取一系列分相臨界點,繪制雙水相相圖。

1.2.2.3 單因素實驗 以1.2.2.1中所述方法,選取影響雙水相體系萃取效果的幾種主要考察因素及條件:PEG分子量(600、1000、1500、2000、4000)及不同PEG的質量分數(10%～20%范圍內以2%間隔遞增)和NaH2PO4的質量分數(13%～25%范圍內以1%間隔遞增);體系pH(2.5、3.5、4.5、5.5、6.5);粗酶液加入量(0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5 g)。分別測定不同雙水相體系的上、下相的體積、酶活及蛋白等參數,通過對實驗結果的分析與比較,探究從鮑魚內臟中萃取分離β-葡萄糖苷酶的最佳雙水相體系的構成條件及規律。

1.2.2.4 正交試驗 在上述雙水相體系構成的單因素實驗基礎上,選取影響試驗的3個主要因素,在各因素選取3個最佳的水平條件,采用L9(34)正交試驗表進行設計做三因素三水平正交試驗,從而對1.2.2.3中的結果進行比較及驗證。分別選取影響試驗的3個主要因素:PEG分子量、PEG質量分數、NaH2PO4質量分數作為考察因素,各因素水平選取不僅需要在最佳水平范圍內選取,還必須滿足實驗組均能成相,體系對β-葡萄糖苷酶萃取效果較好的3個水平條件選取見表1。

表1 雙水相體系β-葡萄糖苷酶正交試驗因素水平Table 1 Extraction factors and levels of orthogonaltest of the ultrasonic assisted β-glucosidase

1.2.2.5 超聲波輔助提取 在制備組成相同的10 g雙水相體系的步驟中,加入超聲波聯合處理[21-22],探究超聲波輔助對雙水相萃取β-葡萄糖苷酶的效果影響。實驗分三組,A:PEG+粗酶液+水混勻,180 W超聲處理5 min后加入NaH2PO4,混勻靜置離心分相;B:NaH2PO4+粗酶液+水混勻,180 W超聲處理5 min后加入PEG,混勻靜置離心分相;C:PEG+NaH2PO4+粗酶液+水混勻,180 W超聲處理5 min后,靜置離心分相。

1.2.3 酶活力與蛋白含量的測定 采用p-NPG比色法,在403 nm處的吸光值來測定β-葡萄糖苷酶的酶活力大小[23]。酶活定義:一定條件下,1 mL酶液在1 min內水解p-NPG產生1 μmol對硝基苯酚(p-nitrophenol)定義為一個酶活力單位(U),標準曲線公式為:y=16.115x+0.0243,R2=0.999 蛋白質含量采用Brandford法進行測定[24],標準曲線公式為:y=0.435x+0.456,R2=0.998。

實驗探究過程中,由于目標酶集中富集于下相,酶活的評價指標以下相為主,計算公式如下[25]:

(上)下相總酶活(U)=(上)下相酶活(U/mL)×(上)下相體積(mL)

下相酶比活(U/mg)=下相酶活(U/mL)/下相蛋白(mg/mL)

相比R=下相體積/上相體積;

分配系數K=下相總酶活/上相總酶活;

萃取率Y=(R×K)/(1+R×K)

純化倍數PF=下相酶比活/粗酶液酶比活

1.3 數據處理

三次實驗所測數據平均值及標準差采用Microsoft Office Excel 2010進行計算,并使用正交設計助手Ⅱ V3.1專業版進行正交試驗設計與顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 雙水相體系中鹽的種類對萃取β-葡萄糖苷酶效果的影響

如圖1所示,以10%PEG1500與20%的不同鹽分別構建雙水相體系對粗酶液進行萃取分離,NaH2PO4的酶活最高,因此后續實驗選擇NaH2PO4作為雙水相中的鹽相進行實驗。

圖1 不同鹽種類對β-葡萄糖苷酶的萃取效果Fig.1 The effect of different types of salton extraction of β-glucosidase

2.2 PEG/NaH2PO4雙水相體系總相圖的繪制

分別繪制PEG600、1000、1500、2000、4000相圖,合并后得總相圖,如圖2所示。

圖2 PEG/NaH2PO4雙水相相圖Fig.2 Phase diagram of PEG/NaH2PO4aqueous two-phase system

相圖的雙節線上方是兩相成相區,該區域作為選取PEG和NaH2PO4質量分數變量的依據。若只依據單一分子量的PEG相圖進行單因素變量(PEG的質量分數及NaH2PO4的質量分數)實驗設計,則實驗的可信度不高。這是由于雙水相的成相特殊性,三個因素之間存在相互間的影響及作用關系,體系的構成及最終萃取效果是在雙水相成相后三者同時作用的結果,因此,1.2.2.3中單因素實驗中變量的選擇必須以綜合相圖(圖2)為依據,分別對PEG600/1000/1500/2000/4000進行實驗條件的選取和實驗設計。2.3中的實驗結果均為固定體系中PEG分子量,在其對應的PEG雙節線上方(成相)區域間隔2%依次選取五個PEG質量分數為固定點,同時以該PEG雙節線上成相臨界點的NaH2PO4質量分數為起點,依次遞增1%進行實驗和比較,并從每張結果圖中選取最佳的雙水相體系進行重復綜合驗證,得到的每種PEG中最佳體系組成,最后再做綜合比較,以此確定最佳的雙水相體系構成。

2.3 雙水相體系的構成對萃取β-葡萄糖苷酶效果的影響

2.3.1 PEG600對萃取β-葡萄糖苷酶效果的影響 分別固定PEG600的質量分數為12%、14%、16%、18%、20%,以體系剛好成相的NaH2PO4質量分數為起點,以1%的變化量依次遞增NaH2PO4質量分數,選擇12%為探究起點是因為當PEG質量分數小于12%,則雙水相成相及后續探究時所需NaH2PO4的質量分數過大,導致分相后上相體積過小,不利于測量,實驗結果如圖3所示;分別選取圖3中最佳的體系點進行綜合實驗比較,結果如圖4所示。

圖3 不同質量分數水平的PEG600/NaH2PO4雙水相體系對β-葡萄糖苷酶分配系數的影響Fig.3 The effect of PEG600/NaH2PO4 aqueoustwo-phase systems with different mass fractionlevels on distribution coefficient of β-glucosidase

圖4 不同質量分數水平的PEG600/NaH2PO4最佳雙水相體系綜合比較Fig.4 The comprehensive comparison of PEG600/NaH2PO4optimal aqueous two-phase systems with different massfraction levels on extraction of β-glucosidase

由圖3可以看出,12%PEG600組成的雙水相體系總體分配系數大,即β-葡萄糖苷酶富集于下相;而當固定PEG600的質量分數后,隨著NaH2PO4的質量分數的增加,分配系數逐漸下降。圖4選取圖3中分配系數最高的體系組合進行綜合比較,PEG600對β-葡萄糖苷酶萃取效果最佳的雙水相體系組成為12% PEG600+21% NaH2PO4。

由圖3和圖4可見,PEG和鹽的質量分數越接近其相應的成相雙節線時,下相對β-葡萄糖苷酶的萃取效果越好,即最佳體系出現在其雙節線成相臨界點處,而隨著PEG和鹽的質量分數的增大,其萃取效果逐漸下降。

2.3.2 PEG1000對萃取β-葡萄糖苷酶效果的影響 分別固定PEG1000的質量分數為10%、12%、14%、16%、18%,以體系剛好成相的NaH2PO4質量分數為起點,以1%的變化量依次遞增NaH2PO4質量分數,結果如圖5所示;分別選取圖5中最佳的體系點進行綜合實驗比較,結果如圖6所示。

圖5 不同質量分數水平的PEG1000/NaH2PO4雙水相體系對β-葡萄糖苷酶分配系數的影響Fig.5 The effect of PEG1000/NaH2PO4 aqueoustwo-phase systems with different massfraction levels on distribution coefficient of β-glucosidase

圖6 不同質量分數水平PEG1000/NaH2PO4最佳雙水相體系綜合比較Fig.6 The comprehensive comparison of PEG1000/NaH2PO4optimal aqueous two-phase systems with different massfraction levels on extraction of β-glucosidase

由圖5可以看出,10% PEG1000組成的雙水相體系總體分配系數最大,即β-葡萄糖苷酶富集于下相;而當固定PEG1000的質量分數后,隨著NaH2PO4的質量分數的增加,分配系數在第一點和第二點出現峰值,隨后逐漸下降。圖6選取圖5中分配系數最高的體系組合進行綜合比較,10% PEG1000+20% NaH2PO4的組合對β-葡萄糖苷酶萃取效果最佳。

由圖5可見,PEG1000的分配行為與PEG600相比略有變化,隨著PEG質量分數的增加,最佳萃取體系組成略有后移,但雙水相體系組成在其雙節線附近時,下相對β-葡萄糖苷酶的萃取效果越好,且隨著PEG和鹽的質量分數的增大,其萃取效果逐漸下降。

2.3.3 PEG1500對萃取β-葡萄糖苷酶效果的影響 分別固定PEG1500的質量分數為10%、12%、14%、16%、18%,以體系剛好成相的NaH2PO4質量分數為起點,以1%的變化量依次遞增NaH2PO4質量分數,結果如圖7所示;分別選取圖7中最佳的體系點進行綜合實驗比較,結果如圖8所示。

圖7 不同質量分數水平的PEG1500/NaH2PO4雙水相體系對β-葡萄糖苷酶分配系數的影響Fig.7 The effect of PEG1500/NaH2PO4 aqueoustwo-phase systems with different mass fractionlevels on distribution coefficient of β-glucosidase

圖8 不同質量分數水平PEG1500/NaH2PO4最佳雙水相體系綜合比較Fig.8 The comprehensive comparison of PEG1500/NaH2PO4optimal aqueous two-phase systems with differentmass fraction levels on extraction of β-glucosidase

由圖7可以看出,10% PEG1500組成的雙水相體系總體分配系數大,即β-葡萄糖苷酶富集于下相;而當固定PEG1500的質量分數后,隨著NaH2PO4的質量分數的增加,分配系數在第二點出現峰值,隨后逐漸下降。圖8選取圖7中分配系數最高的體系組合進行綜合比較,發現雖然分配系數上10%+18%的組成最高,但下相β-葡萄糖苷酶酶活及純化倍數最高的是12%+17%的組成,在下相萃取率相近的情況下,PEG1500對β-葡萄糖苷酶萃取效果最佳的雙水相體系組成為12% PEG1500+17% NaH2PO4。

由圖7和圖8可見,PEG1500的最佳分配行為點不再是雙節線上的成相點,均發生后移,隨著PEG和鹽的質量分數的增大,下相對β-葡萄糖苷酶的萃取效果先增后降,且最佳點均出現在考察的第二個雙水相體系構成點。

2.3.4 PEG2000對萃取β-葡萄糖苷酶效果的影響 分別固定PEG2000的質量分數為10%、12%、14%、16%、18%,以體系剛好成相的NaH2PO4質量分數為起點,以1%的變化量依次遞增NaH2PO4質量分數,結果如圖9所示;分別選取圖9中最佳的體系點進行綜合實驗比較,結果如圖10所示。

圖9 不同質量分數水平的PEG2000/NaH2PO4雙水相體系對β-葡萄糖苷酶分配系數的影響Fig.9 The effect of PEG2000/NaH2PO4 aqueoustwo-phase systems with different mass fractionlevels on distribution coefficient of β-glucosidase

圖10 不同質量分數水平PEG2000/NaH2PO4最佳雙水相體系綜合比較Fig.10 The comprehensive comparison of PEG2000/NaH2PO4optimal aqueous two-phase systems with differentmass fraction levels on extraction of β-glucosidase

由圖9可以看出,10%和12% PEG2000組成的雙水相體系總體分配系數相近且均較大,即β-葡萄糖苷酶富集于下相;而當固定PEG2000的質量分數后,隨著NaH2PO4的質量分數的增加,分配系數在第二點或第三點出現峰值,隨后逐漸下降。圖10選取圖9中分配系數最高的體系組合進行綜合比較,發現雖然分配系數、下相β-葡萄糖苷酶酶活、下相萃取率均最高,因此,PEG2000對β-葡萄糖苷酶萃取效果最佳的雙水相體系組成為10% PEG2000+18% NaH2PO4。

規律總結:圖9可見,PEG2000的分配系數規律發生較大改變,下相萃取效果最佳的體系組成相較于前三者有遠離雙節線的趨勢,即PEG和鹽的質量分數增加范圍在1%～4%之間,萃取效果更好,但超過此范圍后,萃取效果隨之下降。且其分配系數較前三者迅速增大,這是由于β-葡萄糖苷酶在上相分配極少,更多富集中于下相,且兩相分相處富集出現較為明顯的雜質薄層。由圖10可見,雙水相體系的萃取效果隨著PEG質量分數的增加而下降。

2.3.5 PEG4000對萃取β-葡萄糖苷酶效果的影響 分別固定PEG4000的質量分數為8%、10%、12%、14%、16%,以體系剛好成相的NaH2PO4質量分數為起點,以1%的變化量依次遞增NaH2PO4質量分數,結果如圖11所示;分別選取圖11中最佳的體系點進行綜合實驗比較,結果如圖12所示。

圖11 不同質量分數水平的PEG4000/NaH2PO4雙水相體系對β-葡萄糖苷酶分配系數的影響Fig.11 The effect of PEG4000/NaH2PO4 aqueoustwo-phase systems with different mass fractionlevels on distribution coefficient of β-glucosidase

圖12 不同質量分數水平PEG4000/NaH2PO4最佳雙水相體系綜合比較Fig.12 The comprehensive comparison of PEG4000/NaH2PO4optimal aqueous two-phase systems with differentmass fraction levels on extraction of β-glucosidase

由圖11可以看出,10%和12%PEG4000組成的雙水相體系總體分配系數總體較高;而當固定PEG4000的質量分數后,隨著NaH2PO4的質量分數的增加,分配系數分別在前四點都出現過峰值,隨后逐漸下降。圖12選取圖11中分配系數最高的體系組合進行綜合比較,在分配系數相近的情況下,下相β-葡萄糖苷酶酶活最高的是12%+15%的組成,因此,PEG4000對β-葡萄糖苷酶萃取效果最佳的雙水相體系組成為12% PEG4000+15% NaH2PO4。

PEG4000與PEG2000有相似的規律,且由圖11可見,PEG4000總體的分配系數顯著提升,說明目標酶大量富集于下相且酶活較高,而上相目標酶極少。最佳雙水相萃取體系組成則隨著PEG質量分數的增加呈現先平穩后緩慢下降的趨勢。

2.3.6 不同PEG分子量的最佳雙水相體系綜合比較 分別選取圖4、6、8、10、12中萃取效果(下相總酶活、下相純化倍數及萃取率)最佳的雙水相體系組成—Ⅰ:12% PEG600+21% NaH2PO4;Ⅱ:10%PEG1000+20% NaH2PO4;Ⅲ:12% PEG1500+17% NaH2PO4;Ⅳ:10% PEG2000+18% NaH2PO4;Ⅴ:12% PEG4000+15% NaH2PO4。在相同的環境條件下同時進行比較,經過三次平行實驗后,綜合平均結果如圖13所示。

圖13 對β-葡萄糖苷酶有最佳萃取效果的雙水相體系綜合比較Fig.13 The comprehensive comparison of aqueoustwo-phase systems with optimalextraction effect on β-glucosidase

圖13中,體系Ⅴ的實驗結果最佳,雙水相體系構成為12% PEG4000+15% NaH2PO4時對粗酶液有最佳萃取效果,實驗過程是較為全面的對雙水相體系組成進行系統探究,可信度較高。

表3 正交試驗方差分析表Table 3 Analysis of variance of orthogonal test

表4 雙水相最優組合比較Table 4 The comprehensive comparison of optimal aqueous two-phase systems

2.4 最佳雙水相體系的正交實驗結果

正交實驗結果如表2所示。方差分析見表3。

表2 雙水相體系β-葡萄糖苷酶正交試驗結果Table 2 The result on the orthogonal test of theultrasonic assisted β-glucosidase extraction

通過表2的極差R可知,RA

通過實驗結果可以看出,探究雙水相最佳體系組成的正交試驗存在一定的局限性,最終結果與實際結果有偏差,這是由于雙水相體系成相的特殊性,影響雙水相體系組成的因素水平不能簡單的以單因素組合進行設計,不但需要考慮各因素水平所組成的體系實驗組是否都能成相,還需考慮所選擇的因素水平是否在其最優水平范圍內。但若因素水平選擇只考慮最優范圍,則可能導致出現無法成相的實驗組,反之,若只考慮是否成相來選擇因素水平,則對于不同分子量的PEG來說,因素水平并未都在其最優水平范圍內。若同時進行比較,便不具有代表性,無法說明結果為最優體系組成。因此,通過2.3的實驗方法和結果總結出的規律,作為雙水相最佳體系選擇依據則更為可信。

2.5 雙水相體系pH對β-葡萄糖苷酶萃取效果的影響

改變12% PEG4000+15% NaH2PO4最佳雙水相體系的pH,探究pH對β-葡萄糖苷酶萃取效果的影響。由于測量需要,將總體系按比例擴大至20 g。結果如下圖14所示。

圖14 體系pH對β-葡萄糖苷酶萃取效果的影響Fig.14 The effect of pH value on extraction of β-glucosidasewith aqueous two-phase system

如圖14所示,當雙水相體系pH為3.5時,即該雙水相體系未經調節的體系自然pH,下相β-葡萄糖苷酶呈現出最高酶活,萃取率最高。這可能是由于該pH在β-葡萄糖苷酶的最適pH范圍內[26],而通過加入HCl或NaOH改變體系自然pH后,此時加入的HCl或NaOH使體系的構成發生改變,且分相后上、下相pH會再次發生改變,不利于β-葡萄糖苷酶的酶活力回收。

2.6 雙水相體系中樣品加入量對β-葡萄糖苷酶萃取效果的影響

改變12% PEG4000+15% NaH2PO4最佳雙水相體系的樣品(粗酶液)的加入量,探究總質量為10 g的雙水相體系對樣品的最大處理量。結果如圖15所示。

圖15 樣品加入量對β-葡萄糖苷酶萃取效果的影響Fig.15 The effect of sample quantity on extraction ofβ-glucosidase with aqueous two-phase system

當樣品加入量小于等于2 g時,下相酶活呈線性遞增,酶比活也呈遞增趨勢;下相萃取率及分配系數略有下降;當粗酶加入量大于2 g之后,酶比活不再增加,下相酶活增量明顯減緩,下相萃取率和分配系數快速下降,此現象說明粗酶加入量一超過了該雙水相體系萃取能力的最大載荷,因此可以確定總質量為10 g的該雙水相體系的最大處理量為2 g,即該雙水相體系對粗酶液的最大處理量為體系總質量的20%。

2.7 超聲波輔助雙水相對β-葡萄糖苷酶萃取效果的影響

對雙水相技術萃取過程中進行超聲波處理與未進行超聲波處理的萃取效果的比較,結果如下圖16所示。

圖16 超聲波輔助雙水相萃取β-葡萄糖苷酶效果的影響Fig.16 The effect of ultrasonic assisted on extraction ofβ-glucosidase with aqueous two-phase system

經過超聲波處理的雙水相體系總體參數水平略優于無超聲處理體系,其中,C實驗方法:PEG+NaH2PO4+粗酶液+水混勻后再超聲,能略微提高目標酶的萃取效果。因此可以考慮在雙水相萃取過程中加入超聲波輔助萃取。但就經濟效益和實驗成本考慮,不建議增加該輔助步驟。

3 結論

實驗結果表明,對鮑魚內臟中β-葡萄糖苷酶的分離提取效果最佳、獲得酶活最高、回收率最高的PEG/NaH2PO4雙水相體系組成為:12% PEG4000+15% NaH2PO4;該體系pH對雙水相體系萃取效果存在影響,體系自然狀態下的pH即為最適pH;該雙水相體系的飽和處理量為總體系的20%;雙水相萃取過程中加入超聲輔助能夠略微提高β-葡萄糖苷酶的酶活和回收率,即PEG+NaH2PO4+粗酶液+水混勻后,超聲波180 W處理5 min。

通過該實驗結果發現,雙水相體系萃取目標酶存在一定規律:PEG分子量越大,目標酶于下相的分配系數越大,萃取效果越好。同一PEG分子量中,隨著PEG質量分數的增加,萃取效果總體上呈現逐漸下降趨勢,即最佳雙水相體系PEG和鹽的質量分數組成可在其相圖雙節線附近選取。利用該規律可將類似探究雙水相萃取蛋白質的最佳體系組成的實驗設計及方法進行簡化:若選擇PEG600、PEG1000 和PEG1500時只需探究PEG和鹽的質量分數在雙節線上方0%～2%的實驗范圍內遞增進行實驗,即可找到最佳體系;若選擇PEG2000和PEG4000,則PEG和鹽的質量分數遞增的實驗范圍在1%～4%以內,在此范圍內進行比較試驗即可快速且精準找到最佳體系。

上述規律的形成和機理有待進一步實驗探究和解釋,但在雙水相萃取技術中,該規律的總結對最佳雙水相體系的選擇上具有一定的參考價值。該規律也為在生物分離方法中選用雙水相萃取技術提供了一個較為可靠的實驗基礎和新的研究思路。在后續的實驗探索中,將進一步探究該規律的適用范圍及其機理成因,同時還將嘗試探究雙水相二次萃取技術的應用方法及規律。