一株假單胞菌的分離鑒定及其產絮凝劑絮凝特性的研究

李夢茜,蔡承儒,甘國源,曹晶瀟,蔣利榮,張振旺

(1.河池學院化學與生物工程學院,廣西河池 546300; 2.湖北科技學院醫藥研究院,湖北咸寧 437000)

絮凝劑在污水處理過程中能與水體中顆粒物質及色素、重金屬離子等污染物結合,形成較大絮體而沉降,從而能夠凈化水體,絮凝法是水處理常用技術之一[1]。在絮凝劑種類中,廣泛使用的合成高分子絮凝劑往往易引起環境問題,其中一些不易生物降解,或者降解的中間產物對人類及其它生物體有害。為解決這些環境問題,學者們對微生物生產的生物高分子絮凝劑進行了研究,其中有革蘭氏陰性菌SKDX-1產生的蛋白質絮凝劑[2];黃孢原毛平革菌[3-4]、地衣芽孢桿菌[5-6]、嗜堿性芽孢桿菌[7-8]等產生的多糖絮凝劑,值得注意的是多糖絮凝劑在污水處理和重金屬治理中效果明顯[9-11];克雷伯菌[12-15]、海洋桿菌[16]、芽孢桿菌[17]等糖蛋白絮凝劑,糖蛋白絮凝劑在水處理等多個領域有應用[18-19];以及由枯草芽孢桿菌產生的聚谷氨酸[20-24]和黃單胞菌產生的黃原膠[25-26]等均具有絮凝活性,可以作為綠色無害環保微生物絮凝劑。

絮凝菌的絮凝效能以及培養方法直接關系微生物絮凝劑的生產成本,目前報道的微生物高分子絮凝劑的有效絮凝濃度范圍為0.1～90 mg/L[2,27],加之生產成本高,因此真正應用于工業大規模污水處理的微生物絮凝劑很少。所以迫切需要篩選絮凝效能更高、有效絮凝濃度更低、生產成本價廉、適用于各種類型污水懸浮液的微生物絮凝劑,以使微生物絮凝劑能夠在工業領域中廣泛地應用。本實驗從廣西宜州龍江河沿岸排污口污泥中分離篩選絮凝活性菌株,并對其絮凝性能進行研究,為微生物絮凝劑應用于污水處理提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗用污泥樣品 采自于廣西宜州龍江河沿岸排污口;蛋白胨(化學純)、瓊脂粉(化學純)、葡萄糖(化學純)、酵母粉(化學純) 西隴科學股份有限公司;無水乙醇(分析純)、KCl(化學純)、CaCl2(化學純)、NaCl(化學純)、高嶺土(化學純)、AlCl3(化學純)、梅里埃API試條 南京百思一基生物耗材。

SPX-150生化培養箱 上海躍進醫療器械有限公司;ZWY1102C恒溫培養振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司;PHS-25pH計 上海精密科學儀器有限公司;LDZX-50FBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠;超純水制造系統 成都越純科技有限公司;xMark酶標儀 Bio-Rad公司;Phenom Pro X電子掃描顯微鏡 Phenom-World公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 微生物絮凝劑產生菌的篩選與鑒定

1.2.1.1 微生物絮凝劑產生菌的分離純化 采用瓊脂平板培養法,以LB為基礎培養基從宜州污水處理廠污泥樣品中分離生物高分子絮凝劑產生菌。將采集的污泥樣品進行梯度稀釋,取10-5、10-6、10-7三個梯度各100 μL 涂布到LB培養平皿中,30 ℃培養60 h。挑取平皿中形態不同的單菌落采用劃線法接種于新的無菌LB平皿中,反復分離劃線純化,直至平皿中菌落形態一致且穩定。測定分離所得菌株的絮凝活性,選取絮凝活性高的菌株進行鑒定。

1.2.1.2 菌株絮凝活性的測定 以高嶺土懸浮液作為絮凝試驗材料,按照文獻[28]中所采用的方法對純化菌株進行絮凝活性的測定。

1.2.1.3 菌株鑒定 通過觀察其菌落形態、顯微細胞形態,生理生化特征分析,16S rDNA序列測定,確定絮凝劑產生菌的種屬[29]。其中菌株基因序列的測定由生工(上海)股份有限公司完成。

1.2.2 絮凝劑的制備 以微生物絮凝劑產生菌L2019-2為研究對象,在含1%葡萄糖、1%蛋白胨、0.5%酵母提取物的基礎培養基(pH7.0)中,于搖床30 ℃、120 r/min振蕩培養60 h。細菌培養后,在12000×g條件下將發酵液離心10 min后,將細胞懸浮在100 ℃蒸餾水中30 s熱提取后,用12000×g離心10 min,取上清液并加入2倍體積的冷乙醇沉淀微生物絮凝劑,于9000×g離心10 min后收集絮凝劑,溶于蒸餾水中。經過三步乙醇沉淀,再在蒸餾水中透析然后凍干,得到一種微生物絮凝劑。

1.2.3 絮凝活性測定 用高嶺土懸浮液對微生物絮凝劑的絮凝活性進行測定。將0.2 mL微生物絮凝劑溶液、9.8 mL 4 g/L高嶺土懸浮液在離心管中混合,用渦流混合器攪拌混合物并靜置10 min。從離心管的上層小心地取出0.2 mL上清液于96孔板中,測量550 nm處的吸光度(B)。用同樣的方式進行不含絮凝劑溶液的對照實驗,測量550 nm處的吸光度(A)。使用以下公式計算絮凝活性:

μ(%)=(A-B)/A×100

式中:μ 表示絮凝率;A 表示對照上清液的濁度;B 表示加入絮凝劑上清液的濁度。

1.2.4 絮凝條件選擇 微生物絮凝劑的絮凝活性受其濃度、陽離子、反應溫度以及pH的影響[2],于是采用單因素實驗的方法考察了這些因素對L2019-2所產絮凝劑絮凝效能的影響,以期得到最佳絮凝條件。

1.2.4.1 絮凝劑濃度選擇 于9.8 mL 4 g/L高嶺土懸浮液中加入0.2 mL(濃度分別為0.5、1、1.5、2、2.5、3 mg/mL)純化的微生物絮凝劑溶液在離心管中混合,使絮凝劑在混合液中的最終濃度分別為10、20、30、40、50、60 mg/L,用1.2.3方法測定并計算不同濃度條件下的絮凝率,從而得出絮凝劑最佳絮凝濃度。

1.2.4.2 助凝陽離子選擇 在絮凝劑濃度為40 mg/L條件下,以AlCl3·6H2O、FeCl3·6H2O、CaCl2·2H2O、MgCl2·6H2O、NaCl和KCl為陽離子源,測定微生物絮凝劑在含1 mmol/L陽離子的高嶺土懸浮液中的絮凝活性。接著考察對絮凝活性有明顯刺激作用的陽離子的濃度(0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8 mmol/L)對絮凝劑絮凝活性的影響。

1.2.4.3 最適反應pH 在絮凝劑濃度為40 mg/L、助凝劑為0.4 mmol/L Fe3+條件下,考察了絮凝劑在pH為3、4、5、6、7、8、9、10、11時的絮凝活性,以得到最適反應pH。

1.2.4.4 最適反應溫度 在絮凝劑濃度為40 mg/L、pH為5.0、助凝劑為0.4 mmol/L Fe3+時,又考察了絮凝劑在不同溫度(10、20、30、40、50、60 ℃)條件下的絮凝活性,以期得到絮凝劑的最適反應溫度。

圖1 菌株L2019-2的菌落及細胞形態特征Fig.1 Colony and cell morphological characteristic of strain L2019-2

1.2.4.5 各種廢水懸浮液中的絮凝效果 用上述同樣的方法考察了絮凝劑在活性炭(4 g/L)、纖維素(5 g/L)和酵母懸浮液(將面包酵母菌體加入純水中,在550 nm處的吸光度調為1.4即可)中的最佳投加量。

1.2.5 絮凝劑的成分分析 以葡萄糖為標準,采用苯酚-硫酸法測定總糖含量。以半乳糖醛酸為標準,采用硫酸咔唑法測定了糖醛酸的含量。以氨基葡萄糖為標準,采用Morgan-Elson法測定氨基糖。以牛血清白蛋白為標準,采用考馬斯亮藍法測定蛋白質[30-31]。

采用高效液相色譜法對生物高分子絮凝劑純品的單糖組成進行了分析:稱取凍干的樣品2 mg,3 mol/L HCl在100 ℃下水解4 h后,氮吹儀吹干。于水解后干燥得到的單糖樣品中加入0.5 mol/L的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)甲醇溶液和0.3 mol/L NaOH溶液各0.5 mL,混合充分后,70 ℃水浴反應30 min。冷卻至室溫,加入0.3 mol/L的HCl 0.5 mL,混合充分后再加入0.5 mL氯仿,劇烈振蕩萃取,離心后用0.22 μm濾膜過濾后上機分析。使用自動氨基酸分析儀測定微生物絮凝劑的氨基酸含量。

1.3 數據處理

將測序結果首先進行序列拼接得到完整16S rDNA序列,然后將該序列提交到NCBI網站進行BLAST比對分析,同時選取GenBank中10株同源性較高的菌株直接于NCBI網站在線構建系統發育樹。

L2019-2絮凝菌所產絮凝劑的絮凝活性受其濃度、陽離子、反應溫度以及pH的影響。關于影響絮凝率的因素和水平的分析是采用GraphPad Prism 7軟件實現的。

2 結果與分析

2.1 菌株篩選與鑒定

經固體平板分離純化,同時借助鏡檢觀察,從污泥中分離出一株生物高分子絮凝劑產生菌,菌液對高嶺土懸濁液的絮凝率可達78%,且該菌絮凝特性穩定,將該菌命名為L2019-2。

2.1.1 L2019-2的形態與理化特征 L2019-2菌株在LB固體培養基上呈無色圓形透明菌落,其表面光滑、有黏性。鏡檢觀察菌株L2019-2細胞形態呈桿狀(圖1),革蘭氏染色陰性。采用全自動微生物檢測系統API-20-NE對菌株L2019-2進行理化分析,菌株L2019-2的理化特征見表1。依據上述分析結果,L2019-2菌株的形態和理化特征與假單胞菌屬較為一致。

表1 菌株L2019-2的生化特征Table 1 Biochemical characteristic of L2019-2

2.1.2 16S rDNA序列測序 將菌株L2019-2提取總DNA后送上海生工測序,16S rDNA測序結果應用BLAST程序與NCBI數據庫中信息進行同源性比對,構建出系統進化樹。依據Blast比對結果,L2019-2與假單胞菌屬多個種的相似度都很高,其中與維羅納假單胞菌的同源性最高,達99.8%,接著選取10株同源性較高的假單胞菌菌種進一步做了系統進化樹,結果見圖2所示。L2019-2與Pseudomonasveronii位于同一個分支上,具有較近的遺傳距離,結合形態與生化結果分析,將L2019-2絮凝菌歸屬于假單胞菌屬。

2.2 微生物絮凝劑的最佳絮凝條件

2.2.1 絮凝濃度 在高嶺土懸浮液中,微生物絮凝劑的絮凝活性受其濃度、陽離子、反應溫度以及pH的影響。生物高分子絮凝劑在濃度為40 mg/L左右時絮凝活性最高(圖3)。

圖2 L2019-2菌株的16S rDNA序列的系統進化樹Fig.2 The developmental phylogenetic tree of L2019-2based on 16S rDNA

圖3 絮凝劑濃度對絮凝率的影響Fig.3 Effect of concentration on flocculatingactivity of microbial flocculant

2.2.2 最佳助凝陽離子及其濃度 無機懸浮液中陽離子的加入對微生物絮凝劑的絮凝活性有一定影響。以AlCl3·6H2O、FeCl3·6H2O、CaCl2·2H2O、MgCl2·6H2O、NaCl和KCl為陽離子源,圖4顯示了微生物絮凝劑在含1 mmol/L陽離子的高嶺土懸浮液中的絮凝活性。在此濃度下,Al3+、Fe3+和Ca2+能顯著提高絮凝活性(P<0.001)。由于Al3+、Fe3+和 Ca2+對絮凝活性的明顯刺激作用,在高嶺土懸浮液中考察了陽離子濃度對生物高分子絮凝劑絮凝活性的影響,結果如圖5所示。生物高分子絮凝劑的絮凝活性隨Ca2+濃度的增加而提高后趨于穩定,Al3+最佳添加濃度為1.6 mmol/L,Fe3+的最佳添加濃度為0.4 mmol/L。在這些陽離子中,由于Fe3+在低濃度下有效,因此認為Fe3+是提高微生物絮凝劑絮凝活性的一種合適的陽離子。推測Al3+、Fe3+和Ca2+是通過中和與穩定微生物絮凝劑分子中的酸性氨基酸和半乳糖醛酸羧基結合懸浮顆粒后剩余的負電荷而促進絮凝作用的。在懸浮液中加入陽離子是誘導微生物絮凝劑有效絮凝活力的必要條件。本實驗結果與紅潮紅球菌和杯狀假堿菌所產微生物絮凝劑需添加Ca2+和Al3+才具有較高的絮凝活性的報道相一致[32-33]。

圖4 陽離子對絮凝率的影響Fig.4 Effects of cations on flocculatingactivity of microbial flocculant 注:各組與control組相比,***表示顯著(P<0.001)。

圖5 離子濃度對絮凝率的影響Fig.5 Effects of cations concentrationon flocculating activity of microbial flocculant

2.2.3 最適反應pH和溫度 微生物絮凝劑的絮凝活性受反應pH和反應溫度的影響。在pH5.0時(圖6),含0.4 mmol/L Fe3+的高嶺土懸浮液中,生物高分子絮凝劑的絮凝活性最高。生物高分子絮凝劑在含0.4 mmol/L Fe3+的高嶺土懸浮液中絮凝作用的最適反應溫度為30 ℃(圖7)。

圖6 pH對絮凝率的影響Fig.6 Effects of pH on flocculatingactivity of microbial flocculant

圖7 溫度對絮凝率的影響Fig.7 Effects of temperature on flocculatingactivity of microbial flocculant

2.2.4 活性炭無機懸浮液中的絮凝效果 圖8顯示L2019-2所產絮凝劑在活性炭懸浮液中絮凝效果很好,在活性炭懸浮液中的最佳絮凝濃度為30～40 mg/L。因此,該微生物絮凝劑可能適用于含碳無機廢水的固液分離和凈化。

圖8 活性炭懸浮液中絮凝劑濃度對絮凝率的影響Fig.8 Effect of concentration on flocculatingactivity in active carbon suspension

2.2.5 有機懸浮液中的絮凝效果 如圖9所示,L2019-2所產絮凝劑在纖維素、酵母等有機懸浮液中也具有良好的絮凝活性。微生物絮凝劑在纖維素懸浮液中絮凝活性的最佳濃度為40 mg/L。在酵母懸浮液中的最佳絮凝活性濃度為50 mg/L。

圖9 酵母和纖維素懸浮液中絮凝劑濃度對絮凝率的影響Fig.9 Effect of concentration on flocculatingactivity in suspensions of yeast and cellulose

2.3 L2019-2所產絮凝劑的成分分析

依據文獻[1]報道,目前微生物絮凝劑主要由以下幾類化學成分組成:糖類、多肽、蛋白質、核酸和脂類物質。為探究L2019-2菌株絮凝活性產物的化學成分,對其進行如下分析。根據考馬斯亮藍法試驗結果,制備的微生物絮凝劑中含有23%左右的蛋白質;絮凝劑凍干品經水解預處理后,通過自動氨基酸分析儀分析其氨基酸含量(表2),結果顯示該微生物絮凝劑含有15 種氨基酸,其中天冬氨酸和谷氨酸的含量分別為4.6%和5.4%,與其他氨基酸相比相對豐富。

表2 氨基酸種類與含量Table 2 Species and contents of amino acids

表3 單糖種類與含量Table 3 Monosaccharide species and contents

L2019-2所產絮凝劑的總糖含量的測定參照文獻[31],采用苯酚-硫酸法試驗測得其總糖含量約為77%。依據硫酸咔唑法實驗結果測得其酸性多糖中醛酸的濃度約為15%。高效液相色譜法分析單糖含量(表3),經水解后微生物高分子絮凝劑含有10種單糖,以葡萄糖、半乳糖和半乳糖醛酸為主,其含量明顯高于其他糖類。

3 結論

本研究從污泥中分離得到1 株微生物絮凝劑產生菌L2019-2,經形態特征、理化特性和16S rDNA 基因序列鑒定,其屬于維羅納假單胞菌。有研究報道[34],維羅納假單胞菌具有降解芳香族有機污染物能力,可用于污染環境的生物修復等方面。本研究首次從維羅納假單胞菌L2019-2中分離出一種新的糖蛋白絮凝劑。此微生物絮凝劑的絮凝活性受陽離子、pH、溫度等因素的影響。高嶺土懸浮液中添加Ga2+、Fe3+或Al3+時,絮凝活性增加,最佳助凝陽離子是0.4 mmol/L的Fe3+;在高嶺土懸浮液中發揮最佳絮凝活性的pH為5.0;最適反應溫度為30 ℃。并通過單因素實驗初步優化了L2019-2產生絮凝劑的培養條件,接下來會對產絮凝劑的培養條件進一步優化,以期用更為廉價的培養方式獲得更高的產量。由于本研究得到的糖蛋白生物聚合物絮凝劑在各種無機和有機懸浮液中表現出良好的絮凝活性,所以,本研究為微生物絮凝劑的應用奠定了一定的理論基礎,同時為探討污水治理提供了一定的參考。