豌豆分離蛋白-羧甲基纖維素納靜電復合物在乳液中的應用研究

龐淑婕,李娜娜,任 思,劉麗婭,*,佟立濤,王麗麗,周閑容,周素梅,*

(1.中國農業科學院農產品加工研究所,農業部農產品加工重點實驗室,北京 100193; 2.江南大學食品學院,江蘇無錫 214122)

豌豆是重要的豆科作物,豌豆產值占豆類作物總產值的36%[1]。豌豆富含蛋白質(20%～25%)[2-3],豌豆分離蛋白(Pea protein isolate,PPI)氨基酸組成平衡,且賴氨酸含量豐富[4],同時具有低致敏、非轉基因的特點[5],且有益于降低心腦血管等慢性疾病的發生的風險[6]。因此近年來被作為優質的植物蛋白資源應用于食品工業中,尤其是高濃度豌豆蛋白飲料和酸奶產品受到越來越多的關注。

與其它豆類蛋白相似,豌豆蛋白在飲料和酸奶體系中常作為乳化劑、起泡劑,其功能特性與pH、溫度、離子強度等環境因素和加工方式有關[7-8]。然而,酸性飲料和酸奶的pH一般在4.2左右,該pH正好接近豌豆蛋白的等電點(約為pH4.6)。因此豌豆蛋白在這類體系中應用時溶解性和乳化性不佳[9],體系常通過多種機制發生失穩[10],主要表現為脂肪上浮、蛋白絮凝沉淀等,嚴重影響了產品的食用品質和貨架期[11]。

陰離子多糖常被添加到蛋白穩定的酸性乳飲料中,提高蛋白質的穩定性。邱榮[12]研究表明陰離子多糖能夠附著在油滴包裹的蛋白質表面,部分結構深入兩相中,通過增強液滴間靜電排斥或空間位阻,提高乳液的穩定性。然而,在一定條件下,少量的多糖則會導致蛋白乳液體系發生橋連絮凝作用,反而加速乳液失穩[13]。羧甲基纖維素鈉(CMC)是 D-吡喃葡萄糖通過β-1,4-糖苷鍵鏈接而成的陰離子型線性高分子,由于價格低廉,應用性能優異,常作為酸性蛋白飲料的穩定劑[14]。乳液體系的穩定性與CMC濃度密切相關[15],CMC 濃度過低時,蛋白結合部分CMC發生架橋絮凝而使體系失穩,當CMC濃度適量時,對酸性乳飲料的狀態具有改善作用。

本團隊前期研究了PPI和CMC在水相溶液中的相互作用。研究發現當CMC濃度為0.4%、體系pH為4.5條件下,CMC可以與PPI形成穩定的靜電復合物(數據暫未發表)。然而,CMC與PPI在乳液體系中的相互作用及其對乳液穩定性的影響尚不清楚。基于此,本研究擬從PPI與CMC在水相體系中的相互作用入手,研究二者所形成的靜電復合物物對乳液體系的影響。通過分析二者所形成的靜電復合物對乳液ζ-電位、粘度、粒徑、穩定性及液滴聚集程度,以期了解CMC在高濃度PPI酸性乳液體系中的應用特性,揭示CMC引起PPI乳液穩定/失穩的內在機制,為豌豆蛋白在高蛋白植物基酸性乳品和飲料中的開發利用提供理論依據和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

脫皮豌豆 淶水縣金谷糧油食品有限公司;羧甲基纖維素鈉 國藥集團化學試劑有限公司，分子量360 kDa,取代度DS 0.92;葵花籽油 多力葵花籽油;鹽酸、氫氧化鈉分析純 國藥集團化學試劑公司;磷酸鹽緩沖液、尼羅紅、尼羅藍 北京索萊寶生物科技有限公司。

F-4500型熒光分光光度計 日本日立公司;PB-10型pH計 Satorius公司;TB-214型電子天平 美國Denver儀器公司;SC-15型數控超級恒溫槽 寧波新芝生物科技股份有限公司;LGJ-18S型凍干機 北京松源華興公司;DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 上海振捷實驗設備有限公司;XHF-DY型高速分散器 寧波新芝生物科技股份有限公司;APV-2000型高壓均質機 德國APV公司;MS3000型激光粒度分析儀 英國Malvern儀器公司;Zetasizer Nano ZS型ζ-電位分析儀 英國Malvern儀器公司;Physica MCR301型流變儀 奧地利Anton Paar有限公司;Turbiscan Lab? Expert apparatus穩定性分析儀 法國Formulaction公司;880LSM T-PMT型Carl Zeiss蔡司激光共聚焦顯微鏡 德國Zeiss。

1.2 實驗方法

1.2.1 豌豆分離蛋白的制備 參考Lan等[16]的方法并稍做修改。將脫皮豌豆研磨粉碎后,以質量體積比為1∶15的比例分散在去離子水中,用1.0 mol/L NaOH調節pH至9.5。在25 ℃,500 r/min攪拌速度下攪拌1 h后4500 r/min離心20 min。收集上清液后,用1.0 mol/L HCL調節pH至4.5,4000 r/min離心20 min,收集沉淀重新分散于去離子水中,調節pH至7.0。凍干72 h后取出,凍干物即為豌豆分離蛋白(PPI)。經凱氏定氮法測得其蛋白含量為85.50%(N×6.25)。

1.2.2 不同CMC濃度的PPI-CMC混合溶液和乳液的制備 參考賈惜文等[17]的方法將PPI和CMC分別分散在10 mmol/L磷酸緩沖溶液(PBS)中,室溫下攪拌4 h后放置于4 ℃冰箱中過夜以確保完全水化,得到5%PPI和1%CMC母液。將PPI、CMC按照一定比例混合,添加去離子水,配制成PPI濃度為3%,CMC濃度分別為:0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%和0.5%的PPI-CMC混合溶液,充分攪拌溶解后取部分混合溶液用HCl和NaOH緩慢調節pH,得到pH4.5的混合溶液。

取部分混合溶液添加葵花籽油,使葵花籽油濃度為3%。用高速分散器將混合液于10000 r/min下剪切1 min后,于常溫、400 Bar條件下高壓均質兩次,制備成添加不同CMC濃度的PPI乳液。用HCl和NaOH緩慢調節pH,得到pH4.5的乳液,置于4 ℃條件下貯藏備用。

1.2.3 不同CMC濃度的PPI-CMC混合溶液蛋白溶解度及表面疏水性測定 測定混合溶液蛋白溶解度,參考Beck等[18]方法的基礎上做出細微修改。水相溶液12000 r/min離心20 min,為避免蛋白在離心過程中變性,離心溫度為4 ℃,去除沉淀取上清液。不同CMC濃度(0～0.5%)的混合溶液上清液分別稀釋10倍、10倍、10倍、20倍、30倍、40倍,用牛血清白蛋白檢測試劑盒(BCA)測定上清液中可溶性蛋白含量。溶解度計算方法如下:

采用F-2500熒光分光光度計測定水相溶液中蛋白表面疏水性(PSH),參考Reinkensmeier等[19]的方法稍作修改。測定前,混合溶液采用pH4.5的10 mmol/L的PBS稀釋150倍,注入比色皿中,25 ℃靜置平衡。連續滴入10滴濃度為8 mmol/L的熒光探針8-苯胺基-1-萘磺酸-鈉(ANS),每滴2 μL,滴入間隔時間2 min,靜置測其熒光強度。狹縫寬度是10.0 nm,激發波長為390 nm發射波長為470 nm。PSH反映了蛋白表面結合位點的數量和強度。表面疏水性計算公式如下:

式中:Fmax是ANS溶液的濃度,Kd是蛋白溶液最大熒光強度,L0是表觀結合解離常數。

1.2.4 ζ-電位測定 采用Zetasizer Nano-ZS90電位測定儀測定乳液液滴的ζ-電位,參考Liu等[20]的方法并稍作修改。測定前,樣品采用pH4.5的10 mmol/L的PBS稀釋5倍,測定溫度25 ℃。每個樣品重復測定3次,結果取平均值。

1.2.5 乳液粒徑分析 采用Mastersizer 2000粒度分布儀測定乳液液滴粒徑的大小,采用儀器配套軟件進行數據分析。采用體積平均直徑(volume weighted average diameter)d43表征液滴粒度的大小。每個樣品重復測定3次,結果取平均值。參數設置為:分析模式:通用;進樣器名:Hydro 2000MU(A);顆粒折射率:1.520;顆粒吸收率:0.10;分散劑:水;分散劑折射率:1.330;泵的轉速:2500 r/min;測定溫度:25 ℃。

1.2.6 乳液粘度的測定 根據Vélez-erazo等[21]的方法并稍做修改后,采用Physica MCR301流變儀測定乳液的粘度隨剪切速率的變化。測定選用不銹鋼平行板轉子(pp50Ti),設定間距為1 mm,測定溫度25 ℃,平衡時間3 min,剪切速率從0.1到100 s-1。加樣時吸取2.3 mL樣品在平板上,使其分布均勻并防止氣泡產生。每個樣品重復測定2次,結果取平均值。

1.2.7 乳液穩定性分析 乳液穩定性采用Turbiscan Lab穩定性分析儀測定,乳液制備好后,立即取20 mL新制乳液加入圓柱形玻璃小瓶中,并置于穩定性分析儀中,采用多次掃描模式進行測量,測定溫度設為25 ℃,測定時長25 h,得到24條反射光強度(TS,BS,%)隨樣品高度變化的曲線。每隔1 h掃描一次,結果記錄為透射光、背散射光掃描圖和Turbiscan穩定性指數(TSI),其中,TSI指數越小,乳液越穩定[22]。

1.2.8 乳液的微觀結構觀察 采用激光共聚焦顯微鏡觀測乳液的微觀結構,參考趙謀明等[13]的方法并略作修改。在1 mL樣品中加入40 μL混合染料(0.02% 尼羅紅和0.1% 尼羅藍),充分混合均勻。選用60×油鏡,在顯微鏡下初調焦,找到乳液液滴分散平面。選擇488 nm的Ar離子和633 nm的He/Ne 離子激光預掃描,采集熒光圖像。所有液滴熒光圖像按1024×1024像素,2×zoom進行采集。然后用激光掃描共聚焦顯微鏡LAS AF Lite軟件進行圖像分析與數據處理。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 CMC對PPI溶解度和表面疏水性的影響

由圖1可知,當CMC濃度≤0.3%時,3%PPI在pH4.5時溶解度僅為3.06%,PPI溶解度隨著多糖濃度的提高反而略有降低。這可能是因為在多糖分子不足時,CMC分子與蛋白分子發生橋連絮凝作用有關[23]。同時,在CMC濃度≤0.3%時,蛋白的PSH也略有下降,表明多糖的存在可能對熒光探針與蛋白疏水結合位點有一定的屏蔽作用。Xu等[24]報道了由于直鏈淀粉與蛋白的疏水結合作用導致蛋白PSH降低。

圖1 CMC濃度對PPI溶解度性和表面疏水的影響(3% PPI,pH4.5,水相體系)Fig.1 Effects of CMC concentration on the solubilityand protein surface hydrophobicity(PSH)of PPI(3%)at pH4.5 in the aqueous solutions注:同一指標,字母不同表示差異顯著(P<0.05);圖2、圖3同。

CMC濃度≥0.4%時,PPI在pH4.5下的溶解度和PSH均顯著(P<0.05)提高(當CMC濃度>0.5%,由于其用量超出其在飲料體系中最大使用限量,故未做進一步研究)。PPI溶解度的提高與體系形成PPI-CMC靜電復合物,PPI分子間的靜電排斥和/或空間位阻作用提高有關(未發表結果)。Moure等[25]的研究表明蛋白質的溶解性取決于蛋白質分子的親水性/疏水性的平衡,這種平衡取決于暴露于蛋白質分子表面的氨基酸組成。PSH的提高也意味著PPI通過與CMC發生相互作用,使蛋白分子內部更多的疏水性位點暴露出來，預示著經CMC穩定后PPI表面活性得到一定程度的改善。

2.2 CMC對PPI乳液ζ-電位的影響

由圖2可知,在pH4.5條件下,體系未添加CMC時,單一的PPI穩定的乳液ζ-電位絕對值較小,約為+6.72 mV,表明在PPI蛋白的等電點附近(～4.6),液滴表面由于蛋白的吸附,呈正電性。隨著CMC濃度逐漸的提高,界面吸附層上帶有正電荷的PPI與帶有負電荷的呈負電性的CMC分子量不斷增加,CMC分子吸附到PPI分子帶有正電荷的片段上,因此由PPI-CMC復合物所穩定的蛋白乳液ζ-電位由正值轉變為負值,且絕對值隨著CMC濃度的升高而明顯增加,表明乳液體系中油滴間的靜電排斥和空間位阻作用得到增強[15]。曾瑞琪等[26]報道了酸性條件下帶負電荷的高酯果膠吸附到帶正電荷的大豆蛋白表面,與本實驗中ζ-電位變化結果相似。

圖2 CMC濃度對PPI乳液ζ-電位的影響(3% PPI,pH4.5)Fig.2 Effects of CMC concentration on theζ-potential of 3% PPI stabilized emulsions at pH4.5

2.3 CMC對PPI乳液平均粒徑的影響

由圖3可知,對于未添加CMC的乳液,其平均粒徑d43為38.5 μm(圖3)。當CMC濃度≤0.2%時,平均粒徑顯著升高(P<0.05)。尤其當CMC濃度為0.2%時,液滴粒徑增加到70.5 μm。根據pH4.5條件下CMC濃度對PPI乳液微觀結構的影響(圖4)的研究結果可知,未添加CMC或CMC濃度≤0.3%的體系(圖4A～D),發生了嚴重的乳狀液滴絮凝。因此,低濃度CMC引起的液滴平均粒徑的增加主要是由于液滴的絮凝所致。這與較低濃度的CMC條件下,液滴表面吸附的蛋白多糖吸附層的絕對電荷量降低,靜電斥力無法克服液滴間的吸引力,從而引起液滴間橋連絮凝有關。當CMC濃度≥0.4%時,乳液平均粒徑隨著CMC濃度的增加而不斷減小,乳液絮凝得到明顯的抑制(圖4E～F)。當CMC濃度增加到0.5%時,乳液液滴粒徑可降低至11.2 μm。表明在此CMC濃度下形成的PPI-CMC靜電復合物可有效地穩定乳狀液滴的界面層,液滴間的靜電排斥和空間位阻效應增加有效抑制了液滴的絮凝[27]。

圖3 CMC濃度對PPI乳液粒徑的影響(3% PPI,pH4.5)Fig.3 Effects of CMC concentration on the particle size of3% PPI stabilized emulsions at pH4.5

圖4 CMC濃度對PPI乳液微觀結構的影響(3% PPI,pH4.5)Fig.4 Effects of CMC concentration on themicrostructure of 3.0% PPI stabilized emulsions at pH4.5注:圖中A～F樣品CMC濃度依次為:0、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%;紅色標記為油脂,綠色標記為蛋白。

2.4 CMC對PPI乳液粘度的影響

乳液連續相粘度是影響乳液穩定性的重要因素。此外,多糖吸附到蛋白穩定的水油界面上,形成粘彈性凝膠界面結構,也會影響蛋白乳液的穩定性[28]。由圖5可知,在pH4.5條件下,PPI乳液粘度較高,這可能與體系發生嚴重的絮凝有關。隨著CMC濃度增加,體系的粘度首先呈現增加的趨勢,當體系CMC濃度為0.3%時,粘度達到最大值,這可能與多糖誘發的液滴間架橋絮凝造成乳液絮凝程度的增加有關[12]。當CMC濃度達到0.4%時,體系的粘度顯著下降(P<0.05),繼續提高CMC濃度,粘度有一定程度的提高,但仍顯著低于CMC濃度≤0.3%的體系(P<0.05)。添加0.5% CMC引起了體系粘度的增加,可能表明在此濃度下,界面相或連續相中存在的PPI所吸附的CMC均達到飽和,因此未被PPI吸附的CMC以游離態的形式存在于乳液的分散相中,引起體相粘度的升高有關[29]。這與CMC濃度≤0.3%時體系粘度增加的機理存在本質不同,由此可得CMC的增稠作用對乳液穩定的影響不顯著。

圖5 CMC濃度對PPI乳液粘度的影響(3% PPI,pH4.5)Fig.5 Effects of CMC concentration on the viscosity of3% PPI stabilized emulsions at pH4.5

2.5 CMC對PPI乳液穩定性的影響

以樣品池的高度為橫坐標,以透射光和背散射光光強值變化值為縱坐標表征其隨時間變化,結果見圖6。可見,對于單一PPI制備的乳液(圖6A),樣品在放置1 h左右,樣品底部有澄清層出現(透射光強度增加)。隨著放置時間的增加,樣品頂部產生了澄清層(背散射光強度隨減小)而樣品池底部出現了沉淀層,體系非常不穩定。當CMC濃度≤0.3%(圖6B～D),體系的穩定性未得到改善。隨著CMC濃度的增加到0.4%以上(圖6E～F),樣品的穩定性顯著提高,由于乳液失穩產生的蛋白沉淀、液滴絮凝、析水現象得到顯著抑制。

圖6 CMC濃度對PPI透射光和背射光強度的影響(3% PPI,pH4.5)Fig.6 Effects of CMC concentration on the transmission andbacklight intensity of 3% PPI stabilized emulsions at pH4.5 注:圖中A～F樣品CMC濃度為:0、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%。

TSI指數是監測乳液動態穩定性的有效指標,TSI指數越小,乳液越穩定[30]。圖6中乳液穩定性的變化也可以通過圖7中TSI指數的變化來定量分析。由圖7可知,在pH4.5條件下,PPI乳液體系TSI指數較高,放置時間較長時,體系發生嚴重的失穩現象。在一定儲存時間內,CMC濃度≤0.3%的PPI乳液發生嚴重的絮凝和聚結,體系的TSI指數增加,乳液穩定性下降,但放置較長時間時,CMC對體系的穩定性仍產生積極貢獻。當CMC濃度≥0.4%時,TSI指數明顯減小,表明由PPI-CMC穩定的蛋白乳液由于液滴間靜電排斥、空間位阻相應的增強,乳液穩定性明顯改善,液滴絮凝、析水現象得到抑制。這與Zhao等[31]的研究結果類似,當乳鐵蛋白乳液中添加0.05%～0.15%大豆多糖或甜菜果膠時,乳液發生橋連絮凝,濃度超過0.35%時,乳液具有良好的穩定性。

圖7 CMC濃度對乳液TSI指數的影響(3% PPI,pH4.5)Fig.7 Effects of CMC concentration on the TSI of3% PPI stabilized emulsions at pH4.5

3 結論

在pH4.5、CMC濃度≥0.4%條件下,帶負電性的CMC分子與呈正電性的PPI通過靜電吸附作用形成的復合物有效改善了PPI在等電點附件的變性沉淀,明顯提高3% PPI溶液在酸性條件下的溶解性。經CMC穩定的PPI分子,其蛋白內部結構中的部分被埋藏的疏水位點暴露出來,表面疏水性得到提高。對于PPI-CMC靜電復合物穩定的乳液體系(3% PPI,3% 油相),當CMC濃度不足時(≤0.3%),多糖引起的橋連絮凝效應導致乳液體系中的液滴發生嚴重的絮凝現象,乳液粒徑明顯增加,體系失穩嚴重。而當CMC濃度≥0.4%,PPI-CMC形成的復合界面層,有效提高了液滴表面的ζ-電位,液滴間靜電排斥和空間位阻效應的增加,有效地抑制了液滴間引力作用,從而抑制了液滴的絮凝,PPI乳液的穩定性顯著改善,液滴粒徑降低。

本研究表明PPI-CMC靜電復合物對3%PPI乳液體系的穩定作用與CMC的濃度密切相關。考慮到實際食品體系中組分和加工工藝的影響,今后的研究需要關注體系共存組分(如離子、糖、蛋白、油脂的種類和濃度等)以及加工工藝(均質、殺菌條件等)等因素對PPI-CMC乳液體系的影響,從而為豌豆蛋白基酸性乳品和飲料的開發利用提供更為豐富的理論依據和指導。