黃皮果肉可溶性膳食纖維制備工藝優(yōu)化及單糖組成和結構表征

文 攀,裴志勝,朱婷婷,于紫娟,耿玉坤,陳彩玉,薛長風,*

(1.海南熱帶海洋學院,海南三亞 572022: 2.海南省海洋食品工程技術研究中心,海南三亞 572022; 3.海洋食品精深加工關鍵技術省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心,海南熱帶海洋學院,海南三亞 572022)

黃皮[ClausenaLansium(Lour.)Skeels(C.Wampi Blanco)],蕓香科黃皮屬(黃皮果屬)常綠喬木,在我國海南、廣東、廣西、臺灣等地種植較多[1]。黃皮果實富含糖、有機酸、果膠、維生素C、揮發(fā)油、黃酮苷等,且具有健脾開胃、消痰化氣、潤肺止咳、去疳積等功效,具有較高的食用、藥用價值[2]。黃皮果上市時間集中在5月中旬～7月初之間,逢臺風、梅雨季,但果實保鮮方面仍處于瓶頸,不及時加工往往帶來大量黃皮果的損失。目前關于黃皮的果皮、葉子、莖和根等的研究已經(jīng)極大地擴展了黃皮資源的應用[3-12],但黃皮果肉的研究則主要集中于黃皮果醬、果脯、軟飲料等初級產(chǎn)品的開發(fā)[13-18],而關于黃皮果肉膳食纖維的研究則未見相關報道。

膳食纖維是指在人體小腸內抵抗消化吸收而在大腸內能夠完成或部分發(fā)酵的多糖類物質。研究表明可溶性膳食纖維(Soluble Dietary Fiber,SDF)的生理功能有助于預防高血脂、糖尿病、冠心病等疾病[19-22],黃皮果肉中SDF的制備有利于拓展黃皮果的精深加工,為黃皮果的深入開發(fā)利用提供參考。

目前對于膳食纖維的提取主要方法有酸堿法[23]、酶法[24]、超聲波輔助酶法[25-26]、微波-化學法[27]等。酶法制備膳食纖維無溶劑殘留,但不容易破壞提取物結構,且需要適宜的酶解溫度。超聲波的機械振動則有助于膳食纖維的溶出[28],微波則可提供高能使物質內外溫度快速升高。三者的協(xié)調作用對膳食纖維提取的研究鮮有報道。因此,本實驗以黃皮果肉為原料,利用響應面法采用超聲波-微波協(xié)同輔助酶法萃取SDF,對SDF進行結構表征及單糖組分分析,為黃皮果肉SDF的開發(fā)利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃皮果 海南三亞南濱農(nóng)場;糖化酶(10萬U/g) 博立生物制品有限公司;纖維素酶(10萬U/g) 和氏璧生物科技有限公司;95%乙醇、磷酸緩沖液、鹽酸、亞硝酸鈉、溴化鉀(光譜級) 西隴科學股份有限公司;MES-TRIS緩沖液 天津市永大化學試劑有限公司;2′-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS) 合肥博美生物有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼 日本東京化成工業(yè)株式會社;沒食子酸、三氯化鐵、福林酚試劑 國藥集團化學試劑有限公司。

T6新世紀 紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;Pilot7-12E 真空冷凍干燥機 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司;TRACE 1300氣相色譜儀 美國Thermo公司;IRAffinity-1 傅里葉變換紅外光譜儀 日本島津公司;XO-SM300超聲波微波協(xié)同萃取儀 南京先歐儀器制造有限公司;HSC-2差示掃描量熱儀 北京恒久實驗設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 黃皮果肉SDF提取工藝 將一定比例的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH4.0～4.5)加入黃皮果肉粉(M2)中并充分攪拌至混合均勻,加入一定比例的糖化酶、纖維素酶,于超聲波-微波萃取儀中處理(控溫模式55 ℃)[23]。處理液于4000 r/min轉速下離心15 min,取上層液置于4倍的95%乙醇中,4 ℃下靜置過夜。過夜物料4000 r/min轉速下離心15 min,取沉淀物冷凍干燥,得到黃皮果肉SDF粗提物,稱重得M1。SDF得率按下式計算:

式中:Y為SDF得率,%;M1為提取的粗SDF重量,g;M2為樣品重量,g。

1.2.2 SDF凈產(chǎn)率的測定 參考國標GB 5009.88-2014的方法[29],測定黃皮果肉中提取的粗SDF的純度,純度根據(jù)GB 5009.88-2014測定。利用公式計算凈產(chǎn)率如下[30]:

膳食纖維凈產(chǎn)率(%)=Y×純度

式中:Y為SDF得率,%。

1.3 黃皮果肉中SDF的提取單因素實驗

在固定溫度為55 ℃,糖化酶用量為0.5%的基礎上,單因素試驗設計為:設定超聲功率300 W、超聲時間20 min、纖維素酶用量0.6%,考察料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 g/mL條件下SDF的得率;設定料液比1∶25 g/mL、超聲功率300 W、纖維素酶用量0.6%,考察改變超聲時間10、15、20、25、30 min條件下SDF的得率;設定料液比1∶20 g/mL、超聲時間25 min、纖維素酶用量0.6%,考察改變超聲功率100、200、300、400、500 W條件下SDF的得率;設定料液比1∶15 g/mL、超聲功率300 W、超聲時間15 min,考察纖維素酶用量0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%條件下SDF的得率。

1.4 超聲波輔助提取SDF響應面優(yōu)化試驗

根據(jù)單因素試驗結果,以SDF得率為指標,將料液比、超聲時間、超聲功率、加酶量為自變量,設計四因素三水平實驗的Box-Behnken響應面試驗,如表1所示，確定最佳提取條件。

表1 響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.5 黃皮果肉中SDF理化性質測定

1.5.1 膨脹力(SWC)的測定 稱取SDF 100 mg放入10 mL的玻璃試管中,加純水5 mL,振勻后在室溫下放置24 h,即讀取液體中膳食纖維的體積變化。膨脹力用每克干物質的膨脹體積來表示,計算如公式所示[31]。

SW(mL/g)=[膨脹后體積(mL)-干樣品體積(mL)]/樣品干質量(g)

1.5.2 持水力(WHC)的測定 稱取SDF 0.5 g樣品放入100 mL燒杯中,加入純水10 mL,振動均勻后在37 ℃水浴中放置12 h,以4000 r/min,離心15 min后稱重,計算如公式所示[32]。

1.5.3 持油力(OHC)的測定 準確稱取0.1 g SDF置于1.5 mL的離心管中,加入1 g食用花生油,振動均勻后在37 ℃水浴中放置12 h,以4000 r/min,離心15 min后稱重。計算如公式所示[33]。

OHC(g/g)=[吸附后的樣品質量(g)-樣品干質量(g)]/樣品干質量(g)

1.6 SDF的結構表征

1.6.1 掃描電鏡形貌觀察 將冷凍干燥后的樣品固定在樣品臺上鍍金,鍍金方法:離子濺射,鍍金條件:15 kV、15 mA、2.5 min,最后將樣品置于掃描電子顯微鏡(10 kV)下觀察其顯微結構。

1.6.2 傅里葉變換紅外光譜的測定 精確稱取干燥SDF樣品2 mg于瑪瑙研缽中,加入200 mg干燥的KBr晶體,在紅外燈照射下輕輕研磨至極細混勻,用壓片機壓制成薄片,用紅外分光光度計于400～4000 cm-1中紅外區(qū)掃描,測定傅里葉變換紅外光譜曲線[34]。

1.7 SDF單糖組分GC分析

1.7.1 單糖混合物的制備 稱取制備樣品50 mg于安瓿管中,加入10 mL 2 mol/L的三氟乙酸,酒精噴燈封口。將其放置于105 ℃干燥箱中水解8 h,待溶液冷卻至室溫后,70 ℃恒溫水浴加熱10 min。取樣品水解液于具塞試管中,放入50 ℃、0.09 MPa真空干燥箱中干燥[35]。

1.7.2 糖腈乙酰化衍生反應 將1.7.1中真空干燥好的樣品中加入50 mg鹽酸羥胺、2.5 mL無水吡啶,加塞于90 ℃恒溫水浴鍋中加熱30 min,用混合器振蕩混勻,待其冷卻至室溫后加入5.0 mL無水醋酸酐,加塞于90 ℃恒溫水浴鍋中加熱30 min,用混合器振蕩混勻,冷卻室溫即為膳食纖維的單糖衍生物。

1.7.3 標準品單糖衍生化 準確稱取各種單糖標準品10 mg,衍生方法參照1.7.2樣品衍生化。

1.7.4 GC分析條件 色譜柱:日本島津公司Rtx-1毛細管柱(0.5 μm×0.32 mm×30 m);檢測器:氫火焰離子化檢測器;載氣:高純氮,流速1 mL/min,分流比為45∶1。氣化室溫度:280 ℃;檢測器溫度:260 ℃;程序升溫:120 ℃保持2 min,然后以10 ℃/min升至180 ℃,保持8 min,再以10 ℃/min升至240 ℃,保持5 min;240 ℃保持15 min;進樣量:1 μL。

1.8 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 9.1、Excel 2007、SPSS 18.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)的表示方式為平均值士標準差(3次重復)。所有表中數(shù)據(jù)均為3次重復試驗結果的平均值。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 料液比對黃皮果肉SDF得率的影響 由圖1可知,隨著料液比的增大,SDF得率先升高再降低,在料液比為1∶20 g/mL時,得率達到最大值為12.05%。料液比從1∶10 g/mL到1∶20 g/mL,得率升高,可能是由于料液比增大使黃皮果肉粉在溶劑中擴散開來后,與溶劑的接觸面積變大,使得率增大;料液比超過1∶20 g/mL后得率下降,可能是隨著溶劑的增加,反應中的酶濃度降低,使得SDF得率降低,故選擇料液比1∶20 g/mL為中心點。

圖1 料液比對得率的影響Fig.1 The influence of materialliquid ratio on extraction rate

圖2 超聲時間對得率的影響Fig.2 The effect of ultrasonictime on the extraction rate

2.1.2 超聲時間對黃皮果肉SDF得率的影響 由圖2可知,隨著超聲時間的增長,得率整體呈上升的趨勢,在25 min時,得率趨于平緩,一定的超聲波時間可以使溶劑同物料更好地接觸,超聲波的機械振動和空穴效應加快了果肉粉內部的分子移動速度,提升了酶解的效率,使超聲提取的效果更好。但在超聲時間30 min時,醇沉后得到的物質呈果凍狀,出現(xiàn)這一現(xiàn)象可能是因為超聲時間增加,超聲波的機械剪切作用使膳食纖維及果肉中的其他大分子結構遭到破壞[36],從而被部分降解溶出至上層清液中,并在隨后的醇沉處理中與可溶性膳食纖維一并沉淀。故選擇超聲時間25 min為中心點。

2.1.3 超聲功率對黃皮果肉SDF得率的影響 由圖3可知,隨著超聲功率升高,得率呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢,且趨勢較為明顯。在超聲功率為300 W時,達到最大得率為12.01%。在超聲功率小于300 W時,得率升高,是因為超聲波具有一定的空化作用和機械振動的特性,隨著超聲功率的增大,可以在短時間內使黃皮果肉的組織受到破壞,使其中果膠等可溶性物質加速進入緩沖溶劑中,得率升高,在功率為300 W時達到最大。而在超聲功率大于300 W時,得率開始下降,出現(xiàn)這一結果的原因可能是,高功率的機械剪切的作用過于劇烈,使SDF結構也遭到破壞[37],同時超聲波功率過大,會引起纖維酶開始失活,使酶解反應無法順利進行[25],從而造成SDF得率急速下降。故選擇超聲功率300 W為中心點。

圖3 超聲功率對得率的影響Fig.3 The influence of ultrasonicpower on extraction rate

2.1.4 加酶量對黃皮果肉SDF得率的影響 由圖4可知,隨著纖維素酶添加量的增加,SDF得率呈現(xiàn)先增加再減少的趨勢,且趨勢較為明顯。在纖維素酶添加量為0.6%時,達到最大得率12.48%。繼續(xù)增大纖維素酶添加量,SDF得率呈下降趨勢。這是因為隨著纖維素酶用量的提高,纖維素酶將IDF降解為溶解度更高的葡聚糖,SDF得率隨著增大,當纖維素酶用量達0.6%時,SDF得率達到最大。當繼續(xù)增大酶的用量,纖維素酶會將葡聚糖水解為分子量更低的寡葡聚糖、纖維二糖和單糖,在隨后的醇沉反應中難以沉淀,因此SDF得率會明顯下降[38]。故選擇加酶量0.6%為中心點。

圖4 加酶量對得率的影響Fig.4 The effect of enzyme quantity on extraction rate

2.2 響應面試驗結果

2.2.1 響應面模型的建立與分析 利用SAS 9.3建立響應面模型并進行數(shù)據(jù)分析,根據(jù)Box-Behnken設計,以得率為響應值,料液比、超聲時間、超聲功率、加酶量為因變量,設計4因素3水平的響應面分析實驗,空白實驗重復3組,共27 組。試驗因素水平結果如表2所示,方差分析結果見表2所示。

表2 響應面設計試驗及結果Table 2 Response surface design and results

表3 方差分析Table 3 Variance analysis

對照表2中的數(shù)據(jù)進行回歸分析,得到如下二次回歸方程:

2.2.2 響應面分析 如圖5所示,當其他因素水平不變時,兩個因素水平發(fā)生變化對響應值所發(fā)生的影響情況圖。等高線的形狀可以反映不同因素之間交互作用的強弱,等高線為鞍型或橢圓形表示兩者交互作用顯著,等高線為圓形則表示兩者交互作用不顯著[39]。圖5c響應面的曲線走勢陡峭,等高線為鞍型,說明料液比和加酶量兩個因素相互作用顯著;其他交互作用對應的響應面曲面較平緩,表明對響應值無顯著影響,同表3的方差分析結果一致。

圖5 提取條件對黃皮果肉SDF得率影響的交互作用響應面圖Fig.5 Response surface plots of interaction between various extraction conditions on yield of SDF from Clausena lansium sarcocarp

2.2.3 回歸模型的驗證 利用SAS軟件進行分析,得到黃皮果肉中SDF最佳提取工藝為,X1料液比1∶22.97 g/mL、X2超聲時間24.37 min、X3超聲功率279.52 W、X4加酶量0.64%。預測SDF得率Y理論值為12.57%。結合實驗可操作性,將最優(yōu)提取工藝實驗參數(shù)確定為:料液比1∶23 g/mL、超聲時間25 min、超聲功率280 W、加酶量0.64%。稱取等量黃皮果肉5份,按照實驗確定的工藝條件進行驗證實驗,得到的SDF得率平均值為12.55%,與預測值相差0.13%,純度為79.65 g/100 g,凈產(chǎn)率為10.00%,進一步驗證了該回歸模型的擬合度較好,模型較為合理有效。

2.3 黃皮果肉SDF的理化性質

對制備的黃皮果肉SDF進行理化特性指標測定,結果見表4。

表4 SDF的理化性質Table 4 Physicochemical properties of SDF

由表4可知,SDF具有較強的膨脹性,其膨脹力為39.25 mL/g,說明SDF中親水基團和保持水分的網(wǎng)絡結構所占比例較高。SDF具有一定的持水力,充分吸水后導致內容物體積增大,增強飽腹感,加快人體代謝,有助于預防結腸癌等腸道疾病[40];SDF具有一定的吸油力,可吸收脂肪,防止脂肪的堆積。黃皮果肉SDF與藍莓果渣[41]SDF的膨脹力(40.34 mL/g)相比,均有較高的膨脹力,說明黃皮果肉SDF有一定的開發(fā)潛力。

2.4 可溶性膳食纖維的結構表征

2.4.1 可溶性膳食纖維掃描電鏡結果 圖6可知黃皮果肉SDF在高倍鏡下放大600倍結構呈片狀,在1000倍下可見片狀結構表面呈現(xiàn)褶皺狀、致密,在3000倍和5000倍下SDF表明則平滑,呈現(xiàn)褶皺狀,凹槽深,相對表面積大。

圖6 水溶性膳食纖維的掃描電鏡結果Fig.6 SEM results of water-soluble dietary fiber

2.4.2 傅里葉變換紅外光譜 由圖7可知,SDF在3200～3500 cm-1內出現(xiàn)較強的吸收峰,為O-H的伸縮振動峰,由于分子間和分子內氫鍵的形成,此處吸收峰較寬,說明其中處于締合狀態(tài)的氫鍵較多[42]。在2800～2933 cm-1附近出現(xiàn)吸收峰,是糖類甲基和亞甲基的C-H鍵的伸縮振動峰[43];1200～1400 cm-1附近出現(xiàn)的是C-H變角振動峰,這些吸收峰都是糖類的特征吸收峰。在1600 cm-1附近出現(xiàn)了較強的吸收峰,是羧基COO-的特征峰。在1000 cm-1附近存在較大吸收峰,是由兩種C-O伸縮振動引起的,分別為C-O-H和糖環(huán)C-O-C,或者由一級醇的O-H變角振動引起,因此分子存在C-O-H和糖環(huán)C-O-C結構。810 cm-1處有吸收,表明含半乳糖。1418 cm-1附近是C-H的彎曲振動峰,是木聚糖的特征峰[45]。SDF具有糖類的特征吸收峰,有多糖紅外圖譜的典型特征[46]。

圖7 SDF的傅里葉變換紅外光譜分析Fig.7 Fourier transform infrared spectroscopy analysis of SDF

2.5 DF中單糖組成成分含量測定結果分析

2.5.1 單糖線性回歸方程 以各峰面積(pA)為縱坐標(Y),各標準品的質量(mg)為橫坐標(X)繪制標準溶液曲線,計算回歸方程及決定系數(shù)。

表6 樣品中單糖的含量Table 6 Monosaccharide content in sample

結果見表5,決定系數(shù)R2均大于0.98,說明方程擬合良好。

表5 各種單糖的回歸方程及決定系數(shù)Table 5 Regression equations and correlationcoefficients of various monosaccharides

2.5.2 黃皮果肉DF中單糖組分分析 通過對標準品和樣品的衍生物進行氣相色譜分析,對比保留時間對本試驗選取的單糖進行定性分析,由于其他雜質成分的干擾,在標樣和樣品中都出現(xiàn)了一些雜峰。單糖標準品衍生物及黃皮果肉SDF GC出峰圖見圖8、圖9。

圖8 標準單糖GC出峰圖Fig.8 GC chromatogram of monosaccharides注:1:鼠李糖;2:阿拉伯糖;3:半乳糖;4:葡萄糖;5:甘露糖;6:山梨糖。

圖9 SDF中單糖衍生物的氣相色譜圖Fig.9 Gas chromatogram of monosaccharide derivatives in SDF注:1:阿拉伯糖;2:半乳糖;3:葡萄糖;4:甘露糖。

經(jīng)對比標準單糖樣品衍生物和黃皮果肉SDF的保留時間發(fā)現(xiàn),通過比對標準樣品的峰面積,結果見表6。SDF中四種單糖的摩爾比為:12∶7.5∶3∶1(阿拉伯糖∶葡萄糖∶半乳糖∶甘露糖)。SDF中含量較高的單糖依次為阿拉伯糖(36.31%)、葡萄糖(27.59%)。阿拉伯糖、半乳糖主要來自于半纖維酸水解產(chǎn)生的已糖和戊糖[47],研究表明[48],可溶性半纖維素能降低食用高膽固醇飲食大鼠的血清TC及肝臟脂肪積累,可溶性膳食纖維來源的擴展有利于食品行業(yè)的不斷發(fā)展。

3 結論

在固定溫度為55 ℃,糖化酶用量為0.5%的基礎上,黃皮果肉中SDF的最佳提取條件為:料液比1∶23 g/mL、超聲時間25 min、超聲功率280 W、纖維素酶加酶量0.64%,SDF得率平均值為12.55%。純度為79.65 g/100 g,凈產(chǎn)率為10.00%。黃皮果肉SDF的形貌緊密,表明呈現(xiàn)光滑的褶皺型,傅里葉紅外光譜具有多糖類的特征吸收峰。黃皮果肉SDF含有四種單糖,其中阿拉伯糖(36.31%)、葡萄糖(27.59%)含量較高。黃皮果肉SDF具有較強的膨脹性,其膨脹力為39.25 mL/g,說明SDF中親水基團和保持水分的網(wǎng)絡結構所占比例較高。黃皮果肉中可溶性膳食纖維的研究有利于黃皮果精深加工的開發(fā),延伸黃皮果產(chǎn)業(yè)鏈,為黃皮果的應用于食品加工奠定一定的理論基礎。