體外孵化模型中乳酸鹽對肌紅蛋白結構影響的機理

李丙子,魏紅艷,雷 蕓,陳 騁,張玉斌,*

(1.甘肅農業大學食品科學與工程學院,甘肅蘭州 730070；2.蘭州文理學院化工學院,甘肅蘭州 730000)

牦牛(Bosgrunniens)是生長在青藏高原地區的動物之一,是世界上唯一能夠在海拔3000 m以上生存的牛種,牦牛長期生活在高原地區的缺氧、低溫以及飼料缺乏的環境下,具有極高的適應力和抗逆性,牦牛生存環境處于高寒低氧的生態條件,血紅蛋白與肌紅蛋白含量較高,肉色比黃牛肉及豬肉更深紅[1]。在牦牛肉加工、儲運及銷售的過程中,隨著鮮肉貨架期延長和后續的加工處理,肉色表現出穩定性變差、商業價格變低等現象。對于肉類加工業以及零售業來說,生鮮肉在貯藏和零售過程中,其外觀顏色是決定肉商品價值的最重要因素,決定了絕大多數消費者的購買意向[2]。因此,如何對宰后冷藏期間生鮮肉的色澤劣變進行有效的控制,延長貨架期并提高肉制品質量,是目前急需解決的問題。

乳酸及其鹽類最初是以其防腐抑菌作用被應用于肉制品加工業中的[3-4]。但最近十年已有大量研究者報道添加乳酸鹽對肉色穩定性的影響,由此一些學者提出了底物和中間代謝物在肉中高鐵肌紅蛋白(MMb,Metmyoglobin)還原作用途徑的乳酸+乳酸脫氫酶+煙酰胺腺嘌呤二核苷酸體系假說[5-7],同時部分研究者證實了線粒體和胞漿之間存在著乳酸鹽的穿梭作用[8]。乳酸鹽的循環和穿梭是構成多細胞生物氧化還原、能量和物質代謝、酸堿平衡、合成與分解的基本條件[9]。目前有關乳酸鹽增強調控牛肉色澤穩定性的基本機理,研究主要聚焦在以下兩個方面:肌紅蛋白(Myogolobin,Mb)和乳酸鹽的直接互動作用以及酶促反應和細胞系統的間接作用[10]。有相關研究已經證明乳酸鹽可以調節Mb的功能[11]。但是,肉中MMb的還原是一個復雜的反應體系。因此很有必要構造一個體外綜合的肉色穩定性分析方法,以體系研究的思路代替對單一物質的研究[12]。Ramanathan等[13]發現在pH5.6和7.4(4 ℃)體外孵化條件下,乳酸鹽和氧合肌紅蛋白(OMb)的結合改善了氧化還原穩定性。Kim等[14]提出了一種更間接的機制,其中乳酸鹽通過乳酸脫氫酶(Lactic dehydrogenase,LDH)介導的NADH(Nicotinamide adenine dinucleotide),產生從而提高了顏色的穩定性。盡管以前的研究已經評估了乳酸鹽和肉色穩定性之間的關系,但乳酸鹽對Mb的更直接的作用機制并沒有更多的研究。

迄今為止,幾乎沒有研究能夠確認乳酸鹽和Mb的共價加合作用,到底是通過與血紅素輔基還是非血紅素配體結合途徑來調節Mb的功能進而影響肉色穩定性的機制。因此,本實驗從牦牛背最長肌中提取分離Mb體,在體外重建Mb-乳酸鹽體外孵化反應模型,從Mb血紅素輔基的角度出發,采用紫外-可見光譜、熒光光譜和圓二色譜研究乳酸鹽與Mb的相互作用機制,為生物體內乳酸鹽對肌紅蛋白的調控提供可靠實驗數據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

試驗牦牛肉樣品 采樣自甘肅天瑪生態食品科技股份有限公司,選取年齡1～3歲生長發育良好、健康無病的甘南牦牛,屠宰后取牦牛背最長肌,剔除脂肪、筋膜,避光、真空包裝后置于恒溫箱運送回實驗室,在24 h之內進行肌紅蛋白的分離純化;丙稀酰胺溶液、Tris-HCI、SDS、APS、TEMED 分析純;Sephadex G-100 prep grade、DEAE-52 GE;馬心肌肌紅蛋白標品 Sigma;預染Marker 北京康潤科技有限公司;MES 天津光復精細化工研究所。

PPS-2型蛋白純化儀 上海金達生化儀器有限公司;J-810型圓二色光譜儀 日本分光株式會社JASCO公司;LS-55熒光分光光度計 美國PE公司;SP-756P紫外可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司;25 D電泳槽 北京六一儀器廠;TGL-24M臺式高速冷凍離心機 長沙平凡儀器儀表有限公司;AL204電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司;PHS-3C pH計 上海精密科學儀器有限公司;XHF-D高速分散器 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 肌紅蛋白的分離純化與鑒定 參考Thiansilakul等[15]的方法稍加改進。取切碎后的肉樣100 g,在4 ℃預冷的300 mL提取液(含1 mmol/L EDTA、10 mmol/L pH8.0 Tris-HCl、25 g/L Triton X-100)中混合,在低溫高速冷凍離心機中13000 r/min均質30 s,取出勻漿液,將其在9500 g、4 ℃下離心10 min,取上清液,用濾紙過濾后得到Mb粗提液。采用硫酸銨溶液對粗提液進行分級沉淀,飽和度梯度由65%至95%,然后4 ℃條件下3000×g離心10 min后棄去上清液,將沉淀物在5 mmol/L pH8.5的Tris-HCl緩沖液中溶解。然后用提前預冷至4 ℃的相同緩沖液透析10 h,透析液每隔1 h換一次,透析結束后在4 ℃下5000×g離心10 min,得到Mb初級純化液。接下來采用Sephadex G-100凝膠層析分離柱進行精細純化,以5 mmol/L pH8.5的Tris-HCl緩沖液平衡層析分離柱,然后取適量初級純化液上樣,用上述緩沖液以0.5 mL/min的流速進行洗脫,在540和280 nm(280 nm處為蛋白質的特征吸收峰)處檢測吸光值。由于肌紅蛋白在540 nm處具有特征吸收峰,因此,收集在該波長下吸光值較高的蛋白溶液,分離得到的Mb參考Laemmli等[16]的方法對其進行光譜特性和SDS-PAGE鑒定。

1.2.2 肌紅蛋白光譜特性檢測 參考馬蘭等[17]的方法,將經過1.2.1處理后的純化液進行光譜測定已知肌紅蛋白中鐵離子在576 nm處有特征吸收峰,并且在該波長下的毫摩爾消光系數為12.8 L/(mmol·cm),因此根據上清液在576 nm下的吸光值,計算樣品中肌紅蛋白(Mb)的含量,即:

式中:CMb:肌紅蛋白含量,μmol/g;A576:576 nm處吸光值;V:溶液體積,mL;m:樣品重量,g。

1.2.3 SDS-PAGE鑒定 參考Laemmli等[16]的方法。使用SDS-PAGE分析樣品對照組與處理組肌紅蛋白。按照表1分別配制濃度為15%的分離膠和4%濃縮膠。蛋白溶液與樣品緩沖液按體積比1∶1混合均勻后沸水加熱5 min。冷卻后進行電泳,上樣量40 μL,濃縮膠電壓70 V,分離膠電壓120 V。電泳結束后剝離膠面,染色液染色40 min,脫色液脫色至條帶清晰可見。

表1 SDS-PAGE電泳凝膠配方(mL)Table 1 The formula of SDS-PAGE gel(mL)

1.2.4 體外反應模型系統的構建 pH5.6的磷酸鹽緩沖溶液體系(模擬肉成熟過程中pH),Mb溶液濃度1×10-5mol/L,選取乳酸鈣,濃度為1×10-4mol/L,加入提取的Mb溶液中(參考張玉斌等[18]實驗結果0.3%為最佳添加量,加入的乳酸鈣為肌紅蛋白溶液含量的0.3%),對照為Mb磷酸鹽緩沖溶液,4 ℃條件下冷藏72 h,測定0、12、36、72 h,4個時間點肌紅蛋白的結構變化情況。

1.2.5 紫外-可見吸收光譜測定 分別取不同時間點處理樣品移取至1.0 cm石英比色皿,以Mb磷酸鹽緩沖溶液為空白樣品進行對比,掃描300～550 nm波長范圍內的紫外吸收光譜。

1.2.6 熒光光譜測定方法 使用LS-55熒光分光光度計進行測定,測試條件:1.0 cm石英比色皿,激發波長430 nm,熒光發射與激發狹縫寬度均為10 nm,掃描速度500 nm/min,掃描500～700 nm波長范圍內的熒光光譜。

1.2.7 圓二色光譜測定 采用圓二色光譜儀,長波范圍163～900 nm氙燈作為光源;測定條件:掃描范圍190～300 nm,狹縫寬度1 nm,掃描速度50 nm/min,響應時間1 s。

1.3 數據處理

試驗中所有測定均做3次重復,試驗結果表示為平均值±標準差。采用SPSS 19.0統計分析軟件(美國IBM公司)進行試驗數據處理,平均數之間的顯著性差異(P<0.05)通過LSD法進行比較分析,用Origin 8.0軟件(美國Origin Lab公司)進行圖制作。

2 結果與分析

2.1 牦牛背最長肌肌紅蛋白Sephadex G-100凝膠層析分離

圖1可知,Sephadex G-100凝膠柱共分離出3種組分,分為組分1、組分2、組分3,其中三種組分均在280 nm的吸光度系下出現吸收峰,但組分1和組分2未在540 nm處呈現出較為明顯的光譜吸收峰,其中組分3的吸收峰分離度比其他三種組分組分明顯,并且在肌紅蛋白特征吸收峰(540 nm)處,呈現出較為明顯的光譜吸收峰,因此初步判定組分3為分離后的肌紅蛋白提取液。

圖1 牦牛背最長肌肌紅蛋白Sephadex G-100凝膠層析洗脫曲線Fig.1 Elution profile of myoglobin from yak LDon Sephadex G-100 column

2.2 牦牛背最長肌Mb分離純化

由圖2可知對比肌紅蛋白粗提液、初級純化液和精細純化液組分3的SDS-PAGE電泳發現,肌紅蛋白粗提取液中蛋白質種類繁多,并且分子量主要分布于17～45 kDa之間,在17 kDa處有明顯的肌紅蛋白條帶,肌紅蛋白的純度較低,僅為18.52%。經過硫酸銨沉淀初步純化后,雜蛋白種類明顯減少,肌紅蛋白特征條帶處有所加深,肌紅蛋白的純度增加到35.09%,但純度并未達到體外孵化要求。經過高分辨率的Sephadex G-100凝膠層析柱進行精細純化后,得到的組分3中蛋白質的電泳條帶只出現在17 kDa處,說明組分3中蛋白質組分單一,肌紅蛋白純度為94.55%。通過光譜吸收曲線進一步對上述結果進行的驗證,在450～650 nm波長范圍內,肌紅蛋白的特征吸收峰分別出現在了540和580 nm。說明通過Sephadex G-100凝膠層析法能夠得到高純度的肌紅蛋白。

圖2 肌紅蛋白的光譜特性和SDS-PAGE鑒定Fig.2 Spectral characteristics and SDS-PAGE identification of myoglobin注:1:肌紅蛋白粗提取液;2:肌紅蛋白初級純化液;3:肌紅蛋白精細純化液組分3。

2.3 牦牛背最長肌Mb與乳酸鈣結合的紫外-可見吸收光譜分析

由圖3可知,對照組四個不同的時間點在409 nm的吸光度分別為1.31、1.40、1.51、1.38,隨著時間的增長在36 h時達到最大值,處理組在409 nm處不同時間的吸光度為1.96、1.98、1.82、1.79,相比于對照組分別增加了0.65、0.58、0.31、0.41。該現象說明乳酸鈣對Mb分子中的血紅素輔基影響較小。只是與肌紅蛋白表面的氨基酸殘基發生了作用,因為極性氨基酸殘基幾乎全部分布在分子表面,可與水結合,使肌紅蛋白具有可溶性[19]。

圖3 不同時間點下乳酸鈣與肌紅蛋白的紫外-可見光譜特性Fig.3 UV-Vis spectra character of myoglobin at different time

2.4 牦牛背最長肌Mb與乳酸鈣結合的熒光光譜分析

由圖4可以看出,對照組肌紅蛋白的血紅素鐵卟啉環在597 nm處有一個熒光發射峰,當加入一定量的乳酸鈣后,597 nm處發射峰強度減弱,隨著貯藏天數的增加,發射峰強度先增加至12 h最大值,后繼續減弱。但與紫外檢測的結果一致,用熒光光譜檢測肌紅蛋白的鐵卟啉環的發射峰位置沒有發生位移,但它的熒光強度隨著貯藏時間的延長而減弱,添加乳酸鈣的處理組在0、12、36和72 h比對照組分別下降了4.64%、13.50%、18.30%和18.32%,發生熒光猝滅。但并沒有發生紅移或藍移現象(注:藍移或者強度發生變化說明二者相互作用,導致熒光性質改變。如果是因為外來物質的加入使得熒光性質改變,使得熒光基團的疏水性增加,極性變小。紅移則相反),說明乳酸鈣與肌紅蛋白的血紅素鐵卟啉環并未直接發生反應。

圖4 不同時間點下乳酸鈣與肌紅蛋白的熒光光譜特性Fig.4 Fluorescence spectra character of myoglobin at different time

2.5 牦牛背最長肌Mb與乳酸鈣結合的圓二色譜分析

從圖5可以看出,肌紅蛋白的光譜圖是帶有螺旋結構的譜圖,即對照組和乳酸鈣處理組在192、208和222 nm遠紫外區附近,圓二色光譜都明顯可見一個典型的正峰和二個負峰的特征肩峰譜帶,它們均代表α-螺旋結構的特征峰,在反應體系中加入一定濃度的乳酸鈣對肌紅蛋白二級結構的影響甚微,遠紫外區3個特征峰的形狀和肩峰的位置未發生明顯改變,190～240 nm處的圖譜在乳酸鈣處理組中和對照組一樣曲線平滑,說明乳酸鈣并未與Mb血紅素中心Fe原子發生了配位,這與上述紫外-可見光譜、熒光光譜圖結果相吻合。

使用光譜數據用目前較為常用的計算網站K2D2提供的方法進行比較。本研究中選取波長190～240 nm段圖譜擬合51個數據點,經計算和預測,其主要的二級結構為α-helix,對照組中α-helix 的含量為87.70%,β-strand的量為0.48%,在乳酸鈣處理組中α-helix 的含量為87.76%,β-strand的含量為0.47%,對照組與乳酸鈣處理組完全無差異。Mb的CD光譜在K2D2網頁中的擬合結果表明,進一步根據Beer-Lambert定律進行計算驗證,實際測定結果軟件擬合計算結果相差不大。

圖5 不同時間點下乳酸鈣與肌紅蛋白的圓二色譜特性Fig.5 CD spectra character of myoglobin at different time注:pH5.6,Mb溶液濃度1×10-5 mol/L。

3 討論

肌紅蛋白是一種含有血紅素的儲氧蛋白,其在 Soret帶和Q帶的吸收峰是由卟啉環共軛體系π-π*躍遷引起的[20]。Soret帶在409 nm有一個強吸收峰,它是血紅素卟啉環上的特征譜帶,因此紫外一可見吸收光譜在409 nm處的吸收峰能夠反映血紅素輔基與膚鏈的結合情況。馬靜等[21]利用紫外-可見吸收光譜法對肌紅蛋白與Cu2+相互作用進行了研究,發現隨著Cu2+的加入使Mb的的紫外吸收增強并且峰位藍移,說明Mb與Cu2+發生了較強的相互作用。本研究發現隨著乳酸鈣的加入,每個時間點處理組的紫外吸收強度增加,但并未發生藍移說明并未發生較強的相互作用。張越等[22]用分子熒光光譜法和紫外可見分光光度法研究了肌紅蛋白與亞硝酸鈉的相互作用,發現隨著溶液中NaNO2濃度的增加,肌紅蛋白在280 nm處的吸光值不斷增加,說明亞硝酸鈉可使包裹在Mb內部的色氨酸與酪氨酸暴露出來,使發射峰增強,即Mb與亞硝酸鈉發生了相互作用。本研究在進行肌紅蛋白與乳酸鈣相互作用的研究中發現,在不同的時間點上Mb在409 nm處的特征吸收峰吸收強度都略有增加,可能是隨著時間的增加,肌紅蛋白中心Fe2+在空氣中被氧化為Fe3+,使吸收峰強度略有增加。乳酸鈣處理組吸光度值在409 nm處的峰位幾乎沒有變化,該現象說明乳酸鈣對Mb分子中的血紅素輔基影響較小。可能與肌紅蛋白的分子結構有關,因為極性氨基酸殘基幾乎全部分布在分子表面,可與水結合,使肌紅蛋白具有可溶性[23]。而非極性氨基酸殘基大多分布在分子的內部,使內部呈一個疏水空穴。血紅素輔基被包裹在疏水腔中,說明乳酸鈣分子未能進入疏水腔內與血紅素輔基發生相互作用,可能只是與肌紅蛋白外部的氨基酸殘基發生了相互作用。

蛋白質的內源熒光主要來源于色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)殘基。苯丙氨酸的量子產率很低,酪氨酸被電離或者接近氨基、羧基時其熒光幾乎全部猝滅[24],肌紅蛋白和血紅蛋白的核心官能團是heme-Fe2+/3+,位于球蛋白4條肽鏈折疊而成的亞基之中,由咪唑基團N原子和Fe原子相互配位,并由二硫鍵(-S-S-)將heme-Fe 與肽鏈形成穩定結構[25]。肌紅蛋白高級結構的熒光光譜顯示其heme-Fe2+在597.27 nm處呈現其特征熒光發射峰[26],為五配位高自旋結構。Chou等[27]指出肌紅蛋白中鐵卟啉環可發射 596 nm的熒光,并有報道研究了金屬離子同肌紅蛋白的相互作用。研究發現加入一定量的乳酸鈣后,597 nm處發射峰強度減弱,隨著貯藏天數的增加,發射峰強度繼續減弱。用熒光光譜檢測肌紅蛋白的鐵卟啉環的發射峰位置幾乎沒有發生變化,但它的熒光強度隨著貯藏時間的延長而減弱,添加乳酸鈣的處理組在0、12、36和72 h比對照組分別下降了4.64%、13.50%、18.30%和18.32%,說明乳酸鹽體系與Mb發生了相互作用時更接近色氨酸殘基的位置,即對色氨酸殘基微環境的影響較大,造成色氨酸殘基微環境的極性減弱,疏水性增強,Mb內部疏水結構更加緊湊,肽鏈的整體延伸程度有所減少[21],但峰圖并未發生紅移或藍移現象,說明乳酸鈣與肌紅蛋白的血紅素鐵卟啉環并未直接發生反應。

蛋白質二級結構在遠紫外(178～250 nm)區具有特征圓二色譜的變化[28],采用遠紫外區CD技術檢測不同量乳酸鈣對Mb的二級結構變化情況。202和222 nm處的2個負槽反映的是的光譜性α-helix質[29]。林凱蕾[30]通過測試血紅蛋白在4～40 ℃范圍內的變化,發現光譜圖的改變不明顯,計算值也非常接近。因此溫度范圍對肌紅蛋白CD的分析影響不大,所以本研究中體外孵化在4 ℃模擬冷藏條件下通過CD光譜法觀察乳酸鈣與肌紅蛋白的互作過程是具有一定可靠性的。馬靜等[21]通過CD光譜研究了Cu2+與Mb的相互作用,發現Mb與Cu2+作用后α-螺旋的含量由64.0%下降到 61.8%,表明金屬Cu2+離子誘導Mb的二級結構發生了輕微的改變。本研究結發現在乳酸鹽反應體系中加入一定濃度的乳酸鈣對肌紅蛋白二級結構的影響甚微,遠紫外區192、208和222 nm 3個特征峰的形狀和肩峰的位置未發生明顯改變,190～240 nm處的圖譜在乳酸鈣處理組中和對照組一樣曲線平滑,說明乳酸鈣并未與Mb血紅素中心Fe原子發生了配位。綜上所述,乳酸鹽與肌紅蛋白血紅素輔基的相互作用機制,主要是通過非血紅素配體結合的方式對Mb進行調節。

4 結論

采用可見光譜法對冷藏期間牦牛背最長肌肌紅蛋白與乳酸鹽作用機制進行研究,研究結果表明不同光譜法互相佐證了乳酸鹽和Mb的共價加合作用并未發生在血紅素輔基上,而是通過非血紅素配體結合的方式來調節Mb,說明乳酸鹽對牦牛背最長肌的作用機制,進一步為乳酸鹽調控肉色的研究方向提供理論基礎。