正交試驗法優化呼倫貝爾野生柴胡總皂苷的提取工藝

鄧慶華 李敬聰

(呼倫貝爾學院 內蒙古 海拉爾 021008)

前言

柴胡作為中國的傳統中藥材之一，它的藥用歷史十分久遠，需求較高，用途十分廣泛，好處繁多。柴胡具有和解表里、疏肝解郁、舉陰盛陽之功效。而柴胡的主要藥效物質是柴胡皂苷和揮發油等。其中，柴胡皂苷主要為三萜皂苷，對感冒發熱、胸脅脹痛、月經不調等具有十分重要的作用。鑒于柴胡及其活性成分的藥理研究發現，提示柴胡有可能開發成為治療包括癌癥、肝炎、精神抑郁和癲癇病等多種疾病的創新藥物[1]。現如今，對于柴胡的利用，不再局限于傳統的對藥材的直接煎煮，而是通過各種方法將柴胡中的有效成分提取出來，制成藥品。目前對于柴胡有效成分的提取方法已有浸漬法、滲漉法、回流法、正丁醇萃取法、甲醇或乙醇提取—乙醚或丙酮沉淀法、異丙酮溶解重結晶法、超聲提取法、大孔吸附樹脂法、微波輔助提取技術、超臨界CO2萃取法、膜技術、水提技術[2][3]。但是，由于柴胡生長緩慢，市場需求較大，供不應求。長期采挖，導致野生資源和環境遭到破壞。

因此，為節省資源、提高以柴胡皂苷為主要成分的藥劑的生產率，降低生產成本，本試驗采用呼倫貝爾陳巴爾虎旗野生柴胡為研究對象，陳巴爾虎旗位于內蒙古呼倫貝爾市西北部，地處呼倫貝爾大草原腹地，地理坐標為北緯48°48′～50°12′，東經118°22′～121°02′，地勢由西北向東南逐漸降低，年平均風速為3.5m/s，屬于中溫帶半溫潤和半干旱大陸性氣候，野生藥材十分豐富。本試驗以溶劑的濃度、提取時間、料液比、和PH四個因素進行正交試驗，采用紫外分光光度法測定柴胡總皂苷的含量，對柴胡總皂苷的提取工藝進行優化，為呼倫貝爾地區野生柴胡的利用提供參考。

1 儀器與藥品

柴胡皂苷a對照品(成都曼斯特生物有限公司)，丙二醇(天津市大茂化學試劑廠)，無水乙醇(天津市天利化學試劑有限公司)，甲醇(天津市大茂化學試劑廠)，正丁醇(科密歐化學試劑有限公司)，石油醚(天津市天力化學試劑有限公司)，磷酸(天津市宇精細化工有限公司)，氨水(天津市密歐化學試劑有限公司)，對二甲氨基苯甲醛(天津市科密歐化學試劑有限公司)，紫外分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司TU-1810PC)，旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠RE-52AA)。

2 研究方法

2.1樣品處理：將采集好的柴胡根部洗凈后于60℃下進行烘干至恒重、粉碎備用。使用相應濃度的乙醇溶液浸泡2小時。

2.2正交試驗因素水平的設定

選用乙醇為提取溶劑，選取溶劑的濃度、提取時間、PH和料液比四個因素，每個因素選取三個水平，見表1。

表1 正交試驗因素及水平

2.3制備對照品溶液：精密稱取柴胡皂苷a 10.00mg置5mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得柴胡皂苷a 對照溶液。

2.4標準曲線的制備：精密吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8和1ml制備好的對照樣品溶液置于試管中，編號。向每只試管中分別加入1ml對二甲氨基苯甲醛乙醇溶液，搖勻，在70℃恒溫水浴鍋中水浴加熱10min后取出，冷卻至室溫。在向每只試管中加入5.0ml磷酸，在70℃恒溫水浴鍋中水浴加熱10min后取出，冷卻至室溫后用甲醇定容10ml。將液體分別置于比色皿中，在536nm處測定吸光度。以吸光度A為縱坐標，柴胡皂苷a的濃度(mg/ml)為橫坐標，繪制標準曲線[4-6]。見圖1。

圖1 標準曲線

通過圖1可以得出標準曲線為A=3.5871C+0.013，R2=0.9941。柴胡皂苷在0～0.2mg/ml范圍呈現出良好線性關系。

2.5正交試驗：根據因素水平表，選用L9(34)表進行試驗。提取液減壓濃縮后用石油醚萃取三次每次10ml，棄石醚油后用水飽和正丁醇萃取三次。合并正丁醇，減壓濃縮干燥后殘渣用甲醇溶解并定容至25ml[4][7]。采用紫外分光光度法測定536nm處吸光度。

3 結果與分析

按照L9(34)正交表進行試驗，結果見表2。

表2 正交試驗結果

續表2

由表2可知，四個因素對柴胡總皂苷提取效率的影響順序為：提取時間>料液比>PH>溶劑濃度。其中溶劑濃度的三個均值中k2最大，同理得出提取時間k3、料液比k3和PH k3的均值最大。所以，柴胡總皂苷的最佳的提取工藝是PH為10～11，8倍料液比、75%乙醇、提取3小時。

以極差最小的溶劑濃度一列作為誤差列，對試驗結果進行方差分析，見表3。

表3 方差分析

由表3可知，提取時間和料液比對柴胡總皂苷提取效率的影響差異顯著P<0.05；提取溶液PH對柴胡總皂苷提取效率的影響差異不顯著P>0.05。結果表明提取時間和料液比對柴胡總皂苷的提取效率影響較大，提取溶劑的PH對柴胡總皂苷的提取效率影響不大。

4 討論與結論

在選擇的四個因素即提取時間、提取溶劑的濃度、料液比與PH中，提取時間和料液比對柴胡總皂苷提取效率的影響差異顯著；提取溶液PH對柴胡總皂苷提取效率的影響差異不顯著。提取時間對柴胡總皂苷提取效率影響最大，但是通過對試驗數據的觀察，提取時間為3h所得的試驗數據并沒有比提取時間為2h高出太多，這可能與柴胡皂苷的性質有關，柴胡皂苷長時間受熱會分解，從而導致柴胡總皂苷提取率降低，與張玲[8]等研究一致。而且柴胡總皂苷作為柴胡的主要有效物質，它和柴胡的藥效息息相關，所以，要在盡可能的減少柴胡總皂苷因為受熱分解的情況下來延長提取時間，確保將柴胡總皂苷充分提取出來。以免因為提取時間過長，導致柴胡總皂苷分解，形成對藥材的浪費。張國松[9]等在其試驗結果的方差分析中顯示提取時間并沒有顯著差異，而本試驗中提取時間具有顯著差異，這可能是由于時間水平的設置所造成的影響。張國松[9]等設計的時間水平間距較小，可能造成區分度不夠高，最終導致試驗結果顯示為提取時間對柴胡總皂苷的提取率影響不大。所設定的PH的三個梯度對最終試驗結果影響不顯著，柴胡皂苷在弱堿的環境下穩定，堿性太強反而可能不利于保持柴胡皂苷的穩定性，這與張國松[9]等研究一致。提取溶劑的濃度對柴胡總皂苷的提取效率影響不大，造成這種現象的原因可能是由于柴胡皂苷在一定濃度的醇溶液中有沉淀損失，這與張玲[10]等人的研究一致。

本試驗從影響柴胡總皂苷的四個因素(提取時間，提取溶劑的濃度，料液比以及PH)入手，用正交試驗法對柴胡總皂苷的提取工藝進行優化，結合極差分析、方差分析，以減少生產成本、保護環境為本，最終確定了柴胡總皂苷的最佳提取工藝為采用75%的乙醇為溶劑、8倍料液比、PH在8～9之間提取3個小時。