新型抗酸桿菌集菌法臨床應用效果研究

鄒 紅,李劍鴻,陳 果,王曉燕，陳曉帆,李 廠

湖南省湘潭市第一人民醫院檢驗科，湖南湘潭 411101

結核病是全球十大死因之一，據WHO統計，2017年全球約有1 010萬結核病發病病例，而我國作為結核病高負擔國家，結核病防治工作形勢十分嚴峻[1-2]，早發現、早診斷是減少結核病傳播，控制疫情的關鍵[3-4]。痰涂片抗酸染色顯微鏡檢查是“十三五”全國結核病防治規劃實施中的一個重要組成部分，也是診斷結核病最基本的病原學檢查方法。由于痰涂片抗酸染色直接鏡檢陽性率較低[5-6]，不同種類的集菌法能提高痰抗酸桿菌陽性率[7-9]，且各有優劣勢，本研究以新型抗酸桿菌集菌法檢測痰標本中的抗酸桿菌，以液基夾層杯法和直接涂片抗酸染色法為對比，發現新型抗酸桿菌集菌法可以提高抗酸桿菌的陽性檢出率，且通過對原始標本的滅活處理可提高生物安全操作性。現報道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1標本來源 416例肺結核患者來自2019年1月1日至2020年5月15日在湘潭市岳塘區管理的傳染病信息報告系統結核病管理系統中登記在案的病例，診斷依據符合中華人民共和國衛生行業標準-肺結核診斷標準：WS288-2017[10]。按照肺結核患者的管理要求留取痰標本。初診失敗指初診肺結核患者治療第5個月末或療程結束時, 痰涂片或培養檢查陽性,或涂陰患者治療過程中出現痰檢陽性。復治失敗指復治涂陽肺結核患者治療第5個月末或療程結束時,痰涂片或培養檢查陽性。其他屬于8個月末之后的時間段。

1.1.2儀器與試劑 液基夾層杯法抗酸染色液、彭氏夾層杯、消化滅活液、取片針、TQ-12自動離心機均由湖南天騎公司提供；改進型抗酸染色消化集菌液，2%的NaOH(購自天津市恒興化學試劑制造有限公司)和3%的N-乙酰L-半胱氨酸(購自上海阿拉丁有限公司)混合液由本實驗室自配；直接涂片抗酸染色液購自珠海貝索生物技術有限公司。

1.2方法

1.2.1檢測方法 液基夾層杯法嚴格按照液基夾層杯抗酸染色試劑盒說明書步驟操作。新型抗酸桿菌集菌法操作步驟如下：于干凈玻璃試管中按標本和改進型抗酸染色消化集菌的比例1∶(2～4)倍的量加入后震蕩15 s，置78 ℃的水浴箱中20 min后，4 500 r/min離心5 min，棄上清液取沉渣涂片，干片后火焰來回3次固定，再用抗酸染色脫色液沖洗一遍，然后嚴格按照萋尼氏染色顯微鏡鏡檢。為保證結果的可比性，同一份痰標本使用液基夾層杯法和新型抗酸桿菌集菌法操作時保證均為1 mL左右的量。直接涂片法參照《中國結核病防治規劃:痰涂片鏡檢質量保證手冊》[11]操作。

1.2.2質量控制 痰標本抗酸染色鏡檢質量控制參照《中國結核病防治規劃:痰涂片鏡檢質量保證手冊》[11]執行。

1.2.3新型抗酸桿菌集菌法安全性試驗 10份直接涂片抗酸陽性(++++)的標本，5份BD960液體培養結核分枝桿菌陽性的標本，設定不同配比的消化集菌液及水浴時間后，再接種至BD960液體培養基觀察分枝桿菌生長情況，評價新型抗酸桿菌集菌法滅活集菌的安全性。

1.3統計學處理 采用SPSS17.0統計軟件進行統計分析，計數資料以率表示，采用配對χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.13種方法陽性檢出率 416例肺結核患者痰標本同時采用3種方法處理，同一患者同一份痰標本任意一種方法陽性判斷為病原學陽性患者。新型抗酸桿菌集菌法、液基夾層杯法、直接涂片抗酸染色法抗酸桿菌的陽性檢出率分別為44.7%(186/416)、40.1%(167/416)、26.2%(109/416)。

2.2新型抗酸桿菌集菌法和直接涂片抗酸染色法陽性檢出率比較 新型抗酸桿菌集菌法和直接涂片抗酸染色法陽性檢出率比較，差異有統計學意義(χ2=69.59，P<0.05)。見表1。

表1 新型抗酸桿菌集菌法和直接涂片抗酸染色法陽性檢出情況比較(n)

2.3液基夾層杯法和直接涂片抗酸染色法陽性檢出率比較 液基夾層杯法和直接涂片抗酸染色法陽性檢出率比較，差異有統計學意義(χ2=46.40，P<0.05)。見表2。

表2 液基夾層杯法和直接涂片抗酸染色法陽性檢出情況比較(n)

2.4新型抗酸桿菌集菌法和液基夾層杯法陽性檢出率比較 新型抗酸桿菌集菌法和液基夾層杯法陽性檢出率比較，差異有統計學意義(χ2=11.17，P<0.05)。見表3。

2.5初治或復治失敗患者新型抗酸桿菌集菌法和液基夾層杯法檢出比較 以新型抗酸桿菌集菌法檢出陽性為對照，對10例初治或復治失敗患者不同時間段的痰標本進行隨訪跟蹤，發現在10例患者中，隨著治療時間的推移，在觀察時間段內，新型抗酸桿菌集菌法均可以檢出，而液基夾層杯法漏檢8例。見表4。

表3 新型抗酸桿菌集菌法和液基夾層杯法陽性檢出情況比較(n)

表4 10例初治或復治失敗患者新型抗酸桿菌集菌法和液基夾層杯法檢出比較

2.6新型抗酸桿菌集菌法安全性試驗 10份直接涂片抗酸陽性(++++)的標本，5份BD960液體培養結核分枝桿菌陽性的標本經2%NaOH和3%N-乙酰L-半胱氨酸混合液消化，再78 ℃水浴15～20 min后，接種BD960液體培養42 d后未報陽，未見抗酸桿菌生長。而78 ℃水浴時間不足或NaOH和N-乙酰L-半胱氨酸配比不當的處理方式均有抗酸桿菌生長。見表5。

表5 不同NaOH和N-乙酰L-半胱氨酸配比及水浴時間的安全性試驗結果

3 討 論

抗酸染色至今仍是結核病細菌學診斷的主要方法之一，然而痰直接涂片抗酸染色鏡檢靈敏度低，通常痰液中分枝桿菌的濃度達到每毫升5 000～10 000條時才能得到陽性結果，如何提高痰涂片抗酸桿菌鏡檢的靈敏度對結核患者的細菌學檢測工作具有重大意義。本研究課題組前期通過試驗驗證不同濃度的NaOH和N-乙酰L-半胱氨酸消化液，在78 ℃左右(不超過80 ℃)水浴不同時間，新型抗酸桿菌集菌法安全有效的操作標準后，開始對臨床標本做新型抗酸桿菌集菌法臨床應用效果的研究。78 ℃水浴溫度的選擇考慮了結核分枝桿菌對濕熱的靈敏度，然而痰標本如果不液化處理就達不到濕熱對抗酸桿菌的殺滅效果；痰標本的液化處理采用的N-乙酰L-半胱氨酸在高于80 ℃時易失活，單純的N-乙酰L-半胱氨酸對痰液化效果不理想，且結核分枝桿菌對一定濃度的NaOH有抵抗力，本研究通過試驗確定了理想的NaOH和N-乙酰L-半胱氨酸配比及水浴溫度和時間。結核分枝桿菌的抵抗力在中華人民共和國衛生行業標準-肺結核診斷:WS288-2017附錄A肺結核病原學中有提及[10]。

本研究結果顯示，新型抗酸桿菌集菌法抗酸桿菌陽性檢出率要優于液基夾層杯法和直接涂片抗酸染色法。液基夾層杯法、新型抗酸桿菌集菌法與直接涂片抗酸染色法兩兩比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。其原因分析如下：分枝桿菌抗酸性的強弱除與細胞壁的完整性有關以外，還與其細胞成熟和衰老程度有關。抗酸染色的原理是分枝桿菌含有分枝菌酸，可與苯酚復紅牢固結合，不易被酸性乙醇脫色。分枝桿菌抗酸性是菌體內分枝菌酸、RNA蛋白及細胞壁的完整性相結合的綜合反應。液基夾層杯法因采用集菌法能提高痰抗酸桿菌陽性率[12-15]。然而液基夾層杯法使用的消化液在對分枝桿菌的菌體滅活的同時也影響抗酸桿菌的著色性及集菌效果，且由于液基夾層杯法操作時對背景細胞的破壞嚴重，觀察視野背景為白色，比較刺眼，不利于觀察者的觀察，容易造成漏檢，使得液基夾層杯法檢出陽性率(40.1%)稍低于新型抗酸桿菌集菌法(44.7%)。 筆者發現部分初治或復治失敗患者的痰標本在直接涂片抗酸染色陽性的情況下，液基夾層杯法是陰性，而新型抗酸桿菌集菌法因采用對抗酸桿菌菌體損傷較小的化學法和對抗酸桿菌抗酸性沒有影響的物理方法，達到集菌的目的，從而除適用于初診和疑似患者的痰標本之外，也適合于初治失敗或復治患者的隨訪跟蹤。本研究跟蹤10例初治或復治失敗患者不同時間段的痰標本，發現在10例患者中，隨著治療時間的推移，在觀察的時間段內與新型抗酸桿菌集菌法相比，液基夾層杯法漏檢8例。劉燕文等[12]研究也顯示，某些長期服用抗結核藥物的患者其結核分枝桿菌抗酸性減弱，加上消化液對菌體的影響使得用液基夾層杯法檢測變成陰性。

從陽性片閱片的時間成本上比較，同一患者同一份痰標本因集菌法提高了每視野中抗酸桿菌的菌量，需要觀察的視野數可以減少，閱片視野數在中華人民共和國衛生行業標準-肺結核診斷:WS288-2017附錄B分枝桿菌細菌學檢查中有提及[10]，能明顯減輕觀察者的負擔。陰性片的閱片時間沒有差異。

直接涂片抗酸染色法相較于新型抗酸桿菌集菌法和液基夾層杯法雖然陽性檢出率要低，但是也存在對于同一份標本直接涂片抗酸染色陽性而其他2種方法陰性的情況，這與抗酸桿菌菌量很少，且抗酸桿菌在標本中分布有一定的聚集性有關。雖然集菌法也存在漏檢，但標本量使用多的集菌法漏檢的概率會小得多。

本研究的不足之處：因抗酸桿菌的涂片鏡檢存在死菌依然陽性的情況，10例初治或復治失敗抗酸桿菌涂片陽性患者未用同一份標本做結核培養甚至有未做培養的情況。

綜上所述，新型抗酸桿菌集菌法具有快速、簡單、生物安全性高、檢出率高的優勢，優于直接涂片抗酸染色法及液基夾層杯法。