血清新型冠狀病毒 IgM抗體檢測結果分析及臨床價值探討

谷 斌，黃慧琴，魯 爽，黃文學，肖三平

湖南省郴州市第二人民醫院：1.肝病中心；2.檢驗科，湖南郴州 423000

隨著新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)疫情在全球蔓延，高效、快速、準確的實驗室診斷技術是確保患者盡早收治、阻止疫情發展的關鍵環節。實時熒光定量PCR(qPCR)檢測核酸陽性一直是COVID-19臨床確診的最主要指標。隨著人們對qPCR局限性認識的逐漸提高，確診標準已經從最初單一的病原學證據轉變為病原學結合血清學證據[1-2]。研究者積極研發新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)IgM檢測試劑盒，篩選潛在的病毒陽性感染者，盡快隔離感染人群，為阻斷病毒傳播發揮了極大的作用[3-4]。2020年2月22日國家衛生健康委員會發布的《新型冠狀病毒感染的肺炎實驗室檢測技術指南(第二版)》[5]指出，SARS-CoV-2抗體檢測可作為COVID-19感染的輔助診斷。本研究采用膠體金免疫層析技術對SARS-CoV-2 IgM抗體進行檢測，以探討SARS-CoV-2 IgM抗體對COVID-19感染的臨床價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2020年2月12-18日本院門診和住院患者共175例為研究對象，其中，COVID-19確診住院患者23例，非COVID-19住院患者70例，非COVID-19發熱門診就診患者82例；男109例，女66例；年齡2～85歲，平均(43.4±15.5)歲。依據《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案(試行第五版)》[6]，確診病例具備SARS-CoV-2病原學證據。本研究納入的所有病例均通過qPCR方法檢測患者咽拭子標本中SARS-CoV-2核酸，COVID-19病例23例，非COVID-19病例152例。本研究通過本院倫理委員會審批，批號：(2020)臨倫審第(1)號，并批準予以豁免患者知情同意。

1.2試劑與儀器 病毒RNA提取試劑盒、qPCR試劑均為湖南圣湘生物科技股份有限公司提供(注冊證編號：國械注準20203400064)，熒光定量擴增的基因為SARS-CoV-2 ORF1ab基因和N基因，采用上海宏石醫療科技公司提供的SLAN-96P熒光定量儀進行qPCR擴增。SARS-CoV-2 IgM抗體檢測試劑盒由北京熱景生物技術股份有限公司提供(生產許可證編號：京食藥監械生產許20070010，生產日期2020年02月02日)，包被的抗原為SARS-CoV-2真核抗原S蛋白，包括S1蛋白和S-RBD蛋白抗原。

1.3標本來源 所有研究對象均采集空腹靜脈血5 mL，置于紅頭真空采血管內，靜置待血液凝固，3 000 r/min離心5 min，所有患者取1份血清標本備用。采集研究對象咽拭子2份標本(間隔1 d以上)，進行SARS-CoV-2核酸檢測。

1.4試驗方法 SARS-CoV-2 IgM抗體檢測采用膠體金免疫層析技術，SARS-CoV-2核酸檢測采用PCR熒光探針法，所有操作嚴格按照《新型冠狀病毒感染的肺炎實驗室檢測技術指南(第二版)》[5]操作標準和試劑盒操作指南進行。依據《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第六版)》[1]，以SARS-CoV-2核酸檢測法作為“金標準”，對IgM抗體檢測的結果進行統計，分析IgM抗體檢測的陽性率、檢測時間、靈敏度和特異度等。

2 結 果

2.1SARS-CoV-2 IgM抗體檢測結果與SARS-CoV-2核酸檢測結果 175例患者SARS-CoV-2 IgM抗體檢測陽性者30例，陰性者145例，陽性檢出率為17.14%。175例患者中COVID-19患者23例。30例SARS-CoV-2 IgM抗體陽性患者中，COVID-19患者15例，非COVID-19患者15例；145例SARS-CoV-2 IgM抗體陰性患者中，COVID-19患者8例，非COVID-19患者137例，見表1。15例SARS-CoV-2 IgM抗體陽性非COVID-19患者來自于發熱門診9例，慢性乙型肝炎1例，艾滋病2例，繼發性肺結核1例，吸毒1例，尿毒癥1例。

表1 SARS-CoV-2 IgM抗體檢測與SARS-CoV-2核酸檢測結果比較(n)

2.2SARS-CoV-2 IgM抗體檢測的靈敏度、特異度 SARS-CoV-2 IgM抗體檢測的靈敏度為65.22%(95%CI=58.16%～72.28%)，特異度為90.13%(95%CI=85.72%～94.54%)。

2.323例COVID-19患者SARS-CoV-2核酸檢測距離起病時間 剔除2例無癥狀COVID-19患者，21例COVID-19患者SARS-CoV-2核酸檢測距離起病時間為1～13 d，其中1～5 d 8例，>5～10 d 9例，>10～13 d 4例，檢測時間中位數為6 d。

2.423例COVID-19患者SARS-CoV-2 IgM抗體檢測距離起病時間 剔除2例無癥狀COVID-19患者，21例COVID-19患者SARS-CoV-2 IgM抗體檢測距離起病時間為3～21 d，其中3～7 d 5例，>7～14 d 8例，>14～21 d 8例,檢測時間中位數為12 d。13例SARS-CoV-2 IgM抗體陽性者抗體檢測距離起病時間為5～21 d，其中5～7 d 2例,>7～14 d 6例,>14～21 d 5例，檢測時間中位數為13 d。8例SARS-CoV-2 IgM抗體陰性者抗體檢測距離起病時間為3～19 d，其中3～7 d 3例，>7～14 d 2例，>14～21 d 3例,檢測時間中位數為10 d。

經t檢驗，21例COVID-19患者SARS-CoV-2核酸檢測與SARS-CoV-2 IgM抗體檢測距離起病時間比較，差異有統計學意義(P<0.01)。13例SARS-CoV-2 IgM抗體陽性者與8例SARS-CoV-2 IgM抗體陰性者抗體檢測距離起病時間比較，差異無統計學意義(P=0.576)。

3 討 論

COVID-19作為急性呼吸道傳染病已納入《中華人民共和國傳染病防治法》規定的乙類傳染病，按甲類傳染病管理，嚴重威脅到人們的生活、生命健康[7]。盡管qPCR核酸檢測在臨床診斷中發揮了重要作用，但限于技術和操作復雜等因素，檢測時間一般需耗時5～6 h，導致患者在醫院就診等待時間較長，增加了患者在醫院交叉感染的風險，不適用于快速診斷，也不能完全滿足當前排查診斷的檢測需要，并且由于大體積反應系統和非特異性擴增，可能會增加假陽性[8]。另外，受到標本采集(時間、部位、類型)、標本運輸和保存、檢測試劑等方面的影響，可能造成檢測結果假陰性。因此，探索更快、更便捷、更多的檢測方法是疫情防控中的重要任務。人體感染 SARS-CoV-2后，會激活人體免疫系統，產生針對性IgM抗體，《新型冠狀病毒感染的肺炎實驗室檢測技術指南(第二版)》[5]提出采用血清標本進行抗體檢測的要求。抗體檢測是病毒感染的重要診斷方法，標本來源于外周血、血清或血漿標本，其采集和保存簡單易行，可大大降低醫護人員因采集咽拭子感染的風險。SARS-CoV-2感染后，患者核酸轉陰后抗體亦可繼續存在，抗體檢測對于SARS-CoV-2疫情的回顧性診斷和流行病學調查亦具有重要意義。因此，在臨床上開展抗體檢測勢在必行。

本研究對膠體金免疫層析技術檢測SARS-CoV-2 IgM抗體進行臨床性能驗證。該試劑盒包被的抗原為SARS-CoV-2真核抗原S蛋白，包括S1蛋白和S-RBD蛋白抗原。S蛋白是SARS-CoV-2的主要蛋白之一，其編碼基因可用于病毒分型，作為診斷抗原。免疫檢測是目前常用冠狀病毒檢測和診斷的方法[9]，免疫層析法為早期診斷冠狀病毒感染的方法之一[10]。本實驗應用捕獲法檢測血液標本中的SARS-CoV-2 IgM 抗體，通過與膠體金固定的S蛋白特異結合，達到檢測目的。該方法操作簡單、快捷，成本低廉，無需特殊設備，易推廣，在當前復工大潮篩查中可以發揮重要作用。

本組資料顯示，SARS-CoV-2 IgM抗體檢測靈敏度為65.22%，提示檢出COVID-19感染的能力不足，需要結合其他檢測手段和臨床表現來判斷；特異度為90.13%，提示判斷無COVID-19感染的能力較好，可用于臨床初篩COVID-19感染，抗體陰性者患COVID-19疾病的可能性不大，結合臨床表現和流行病學史可以初步排除COVID-19，可以作為臨床COVID-19 篩查和診斷的必要補充。據文獻報道，流感病毒抗原膠體金檢測方法的靈敏度為55.6%，特異度為75.9%[11]。另有文獻報道，SRAS-CoV IgM抗體檢測的靈敏度為52.80%,特異度為99.40%,診斷符合率為78.82%[12]。因此，抗原-抗體檢測方法靈敏度低、特異度強的特點較為顯著，與本組研究觀察一致。抗原-抗體檢測靈敏度較低的原因可能與標本采集時間點和抗體產生的生理過程相關。其次，本試驗IgM抗體檢測采用捕獲法，靈敏度偏低，當標本中抗體滴度較弱時，可能出現IgM試劑未能檢出。故有必要對SARS-CoV-2 IgM抗體的靈敏度進行深入的研究，增加試劑包被片段，擴大檢測位點，提高抗體檢測對COVID-19的診斷率。

由于該檢測體系采用了鼠抗人IgM單抗捕獲人血中的IgM抗體，標志物的靶標為人IgM，而不僅僅是SARS-CoV-2 IgM，存在一定的非特異性反應。主要影響因素有慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎、結核病、自身免疫性肝病、系統性紅斑狼瘡、類風濕疾病、嚴重感染或經過抗體藥物治療，以及有嚙齒類動物接觸史等，在這些患者中可能出現交叉反應，導致假陽性，因此，病史采集時需要特別關注這些信息。抗體檢測假陽性可能與試劑盒本身檢測差異有關，也可能與SARS-CoV-2的感染機制有關，有待進一步研究。

本組資料顯示，SARS-CoV-2 IgM抗體檢測距離起病時間為3～21 d，檢測時間中位數為12 d。剔除2例無癥狀核酸篩查陽性者，13例SARS-CoV-2 IgM抗體陽性者抗體檢測距離起病時間為5～21 d，檢測時間中位數為13 d,其中>7～14 d 8例,>14～21 d 8例。 提示SARS-CoV-2 IgM抗體在發病5 d后可以檢出，>7～21 d IgM抗體檢測的陽性率較高，推測IgM抗體檢測的最優時間點為發病后第8天，而核酸檢測的最佳時間為3～5 d[13]，可見核酸檢測時間更早。SRAS-CoV感染發病后第10～20天的血液中檢測特異性IgM抗體陽性率升高，與SARS-CoV-2 IgM抗體檢測時間相近。抗體產生可能與病毒感染機體的特殊致病機制、潛伏期等因素有關[14]，提示SARS-CoV-2 IgM抗體檢測是對核酸陰性的重要補充，可用于COVID-19感染的篩查和輔助診斷，并對病毒感染急性狀態進行評估，但還需要進一步對血清特異性抗體消長和持續時間進行研究。

21例COVID-19患者SARS-CoV-2核酸檢測和SARS-CoV-2 IgM抗體檢測距離起病時間比較,差異有統計學意義(P<0.01)，與病毒核酸產生早和針對病毒的抗體產生時間不同、持續時間不一致有關，提示不同類型標本采集時間不同可能導致檢測結果不一致。

綜上所述，抗體血清學檢測的標本來源于外周血、血清或血漿，其采集和保存簡單易行，特異度較高，判斷無COVID-19感染的能力較好，可用于臨床初篩COVID-19感染。因此，SARS-CoV-2 IgM抗體檢測對核酸檢測容易漏檢的問題是很好的補充，將在COVID-19的診斷、治療監測和病程轉歸等方面提供更多的臨床數據。本研究僅為初步探索，納入病例數較少，且標本連續性不足，不同類型標本采集時間不同可能導致檢測結果不一致，有必要對SARS-CoV-2 IgM抗體產生的規律性和檢測的準確性進行深入研究，為COVID-19提供更多的臨床數據。