應用COPAN WASPLab評估痰液標本經不同液化劑作用后的細菌分離和接種效果

白 露，周 柯，鄭 恬，于恒超

空軍軍醫大學西京醫院:1.檢驗科;2.肝膽外科，陜西西安 710032

隨著對微生物學研究和技術手段的變革創新，微生物自動化實驗室建設已悄然興起，并引領著臨床微生物走進全面自動化的新時代[1-2]。在實驗室常規標本接種及應用自動化接種儀接種時，均要求痰液標本均勻液化，合格均質的標本是保證培養質量及后續正確鑒定的前提。所以，如何選擇適宜痰液標本均質化的試劑，成為困擾實驗室接種的一大難題。本研究應用COPAN WASPLab全自動接種孵育流水線系統，與傳統的手工直接接種法進行比較，旨在為臨床實驗室工作中選擇合適的痰液標本前處理方法提供參考依據，現報道如下。

1 材料與方法

1.1材料 收集2018年7-10月本院呼吸科重癥監護病房(ICU)及麻醉ICU患者經呼吸道抽出的痰液標本100份(>3 mL)為研究對象，另收集同期呼吸科患者自主咳出痰液標本105份(含唾液及黏稠膿性痰液)為對照。根據《全國臨床檢驗操作規程》第4版[3]標準作痰液標本合格性篩查。選取ATCC 700603肺炎克雷伯菌、ATCC 25923金黃色葡萄球菌、ATCC 27853銅綠假單胞菌、ATCC 19606鮑曼不動桿菌、ATCC 49619肺炎鏈球菌及ATCC 49247流感嗜血桿菌，傳代培養。

1.2儀器與試劑 COAPN SL solution 1 mL二硫蘇糖醇(DTT)痰液化劑、COPAN無菌螺旋挑痰棒購自意大利Copan公司，SPUTASOL痰液化劑購自英國Oxoid公司，胰蛋白酶干粉購自美國Sigma公司。SPUTASOL 痰液化劑配制：7.5 mL濃縮液加入無菌蒸餾水92.5 mL，現用現配，可4 ℃保存48 h。1%胰蛋白酶溶液配制：稱取1 g胰蛋白酶干粉,加入100 mL無菌PBS中(pH 7.6)低速攪拌混勻，過濾除菌，可在4 ℃短期保存或-20 ℃分裝凍存，避免反復凍融，宜盡快使用完畢。血平板、嗜血巧克力平板、麥康凱平板購自鄭州安圖生物技術有限公司。COPAN WASPLab全自動接種孵育流水線系統購自意大利Copan公司。

1.3方法

1.3.1液化劑作用不同時間點接種的效果評估 分別取肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、肺炎鏈球菌及流感嗜血桿菌，配制成0.5麥氏濁度菌懸液，各取10 μL分別加入1 mL無菌生理鹽水、COAPN SL solution、OXOID SPUTASOL、1%胰蛋白酶溶液中振蕩混勻。應用COPAN WASPLab全自動接種孵育流水線系統取1 μL在作用0、15、30、45、60、75、90、105、120 min時間點接種。

1.3.2抽出痰液標本的處理方法 呼吸道抽出痰液標本100例，以手工直接接種法為對照，按稱重法分配，大致分為3等份，分別應用COAPN SL solution痰液化劑、OXOID SPUTASOL痰液化劑、胰蛋白酶溶液1∶1液化。將液化后的痰液接種孵育，以平板上的單個菌落數量計數為評判標準：≤5個，+；>5～20個,++；>20～35個,+++；>35個,++++。若該標本中含有2種致病菌，以分離量較少的病原菌數為準，用以評估[4]。參照手工計數標本，比較3種液化劑的液化時間、接種效果及單個菌落分離數量。

1.3.3咳出痰液標本的處理方法 患者自主咳出痰液標本105例，均含唾液及黏稠膿性分泌物，做痰液標本合格性篩查，涂片初步評估為不合格痰液標本,分為3組，每組35份。以手工直接接種為對照組，COAPN SL solution液化劑組應用COPAN無菌螺旋挑痰棒挑取膿性或帶血部分痰液，放入管內液化。OXOID SPUTASOL組及胰蛋白酶溶液組，需用無菌生理鹽水洗滌，去除通過口腔咳出的痰液中混有的正常菌群部分，取痰液膿性部分等比液化。以上處理后的痰液膿性部分經痰液標本合格性篩查，為合格痰液標本。參照手工計數標本，以QIS菌落分離質量分數為判讀標準[5]，評估以上3種方法處理后的標本的分離質量分數。

1.3.4液化后的效果及孵育 入組標本均需震蕩混勻(2 000 r/min，3 0 s)，置于37 ℃孵箱液化15 min，觀察液化效果，以無結塊可流動為宜，如未達到均質化水平，延長孵育時間至完全液化。應用COPAN WASPLab全自動平板接種儀取1 μL接種。血平板及巧克力平板5% CO2孵箱孵育，麥康凱平板35 ℃孵箱孵育，16 h后自動拍攝菌落圖片，觀察結果。

1.4統計學處理 所有數據均采用SPSS19.0軟件進行統計分析，計數資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1痰液化不同作用時間對呼吸道常見致病菌的影響 以生理鹽水為對照，COAPN SL solution及OXOID SPUTASOL在0～120 min內對肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、肺炎鏈球菌及流感嗜血桿菌均無明顯的抑制作用，四區均有生長。胰蛋白酶溶液對肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌無明顯的抑制作用，四區均有生長；但在作用15 min后，對肺炎鏈球菌及流感嗜血桿菌出現抑制作用,且菌量隨著時間的延長逐步減少，在60 min時，被完全抑制，無肺炎鏈球菌及流感嗜血桿菌生長。

2.2抽出標本液化效果及所需時間比較 在使用3種痰液化劑分別作用于同一標本后，皆能達到均質化水平無結塊，呈可流動的均勻痰液，可通過微生物自動化儀器接種自檢。但經評估，所需的液化時間略有不同，COPAN SL solution在30 min內完成的液化標本占92%(92/100)；OXOID SPUTASOL占90%(90/100)；胰蛋白酶溶液占95%(95/100)。各液化結果比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.3抽出痰液標本處理后單個菌落分離數量評估 患者留取的100份痰液中，痰培養陽性71份。本實驗入組標本因多來源于住院患者，故未分離出肺炎鏈球菌及流感嗜血桿菌。其中19份標本只生長革蘭陽性球菌，在含萬古霉素的巧克力平板及麥康凱平板上不生長，故評估此兩類平板僅有52份為統計標本。

在使用3種痰液化劑分別作用于同一標本后，皆能達到良好的接種效果，見圖1。對上述血平板、嗜血巧克力平板及麥康凱平板中的單個菌落分離數量評估，分別應用痰液化劑處理后的標本間差異無統計意義(P>0.05)，但分別與手工直接接種法兩兩比較，均顯著高于手工直接接種法，差異有統計學意義(P<0.001)。見表2。

表1 3種痰液化劑不同液化時間的標本數(n)

表2 單個菌落分離數量評估(n)

注：A表示COAPN SL solution接種效果;B表示OXOID SPUTASOL 接種效果；C表示胰蛋白酶溶液接種效果。

表3 手工直接接種法與挑痰法+COPAN SL solution的效果評估(n)

2.4咳出痰液標本處理后菌落分離質量分數評估 參照手工直接接種法接種標本，以菌落分離質量等級為評判標準。分別評估去除唾液成分后，痰液化劑對痰液標本的影響。結果表明，無論應用COPAN無菌螺旋挑痰棒挑取膿性痰液的方法，還是無菌生理鹽水洗痰法，與手工直接接種法兩兩比較，其菌落分離質量分數水平均高于手工直接接種法(P<0.05)，見表3～5。

表4 手工直接接種法與應用生理鹽水洗痰法+OXOID SPUTASOL效果評估(n)

表5 手工直接接種法與應用生理鹽水洗痰法+胰蛋白酶溶液的效果評估(n)

3 討 論

在國內，大部分醫院仍然采用不液化痰液標本、直接無菌棉簽接種的方法。由于痰液標本受采集方法不正確的限制，往往標本唾液成分較多，受上呼吸道黏膜表面及其定植菌的影響，致使途經口咽部咳出的痰液常受到干擾[6-7]。且病原菌感染肺部在下呼吸道深處，炎癥會局限在炎性滲出物中，導致有意義的病原菌包裹其中，難以突破炎性滲出物的包圍，直接接種不利于細菌的生長，而痰液的均質化處理則利于細菌的暴露，以便細菌更好地生長，提高痰液中致病菌的檢出。

本研究結果顯示，應用COPAN WASPLab全自動接種孵育流水線系統評估COPAN SL solution、OXOID SPUTASOL及胰蛋白酶溶液均對痰液有良好的均質作用，且液化效果良好，單個細菌數量均優于手工直接接種法，因此，可以滿足常規痰液接種及微生物自動化接種儀器的上機需求[8]。其中，COPAN SL solution 及OXOID SPUTASOL主要成分均為DTT及PBS，二者主要成分并無差異。DTT是一種很強的還原劑，可用于蛋白質中二硫鍵的還原，在痰液標本中，利用DTT可使糖蛋白纖維絲之間交聯的二硫鍵打開，降低痰液的黏稠度，從而溶解黏液中雜質等非有效成分，分散細胞，使得黏稠的痰液均勻呈液化狀態；且在PBS中可保證鹽平衡作用，調整適宜的pH值，維持最佳的條件，以保證生物活性物質具有最完整的特性。二者區別在于，COPAN SL solution為1 mL成品，無須配制，直接使用，且采用改良技術真空包裝，穩定性長達2年之久；加之配以COPAN無菌螺旋挑痰棒，可直接挑取痰液中的膿性成分，避開唾液干擾，無需增加洗痰步驟，節省時間，便于上機使用。加入痰液后在震蕩時，螺旋狀的設計可加速助力痰液的液化時間及效果。OXOID SPUTASOL液化劑則在使用前須將濃縮液加入到蒸餾水中,配制成100 mL稀釋液,效期很短，只能在48 h內保證其穩定性；在使用時,含唾液的標本，推薦增加生理鹽水洗脫，但此步驟較繁瑣，耗時長，不宜大樣本量廣泛應用，且因痰液量的差異，每一份痰液液化的時間不一樣，痰液量較多的標本，還需增加液化劑的使用量及液化時間，才能確保其均質化的效果及上機驗證[9-10]。

近年，也有較多研究應用胰蛋白酶溶液作為痰液化劑，胰蛋白酶為肽鏈內切酶，對氨基酸肽鏈有選擇性水解作用，可分解黏液型痰液及膿性痰液等黏性分泌物，但其活性與其濃度、作用時間密切相關，液化過度會導致細胞損傷及菌體的破壞。特別在液化痰液時，不宜時間過長，經本研究發現，胰蛋白酶溶液雖然對于常見呼吸道致病菌并無影響，但是對肺炎鏈球菌及流感嗜血桿菌有抑制作用，易導致菌落計數出現偏差及遺漏菌體的檢出。故應依據自身實驗室要求，酌情選擇合適的液化劑。

本研究均應用統一的接種標準，COPAN WASPLab全自動接種孵育流水線系統是一種高級的機器平臺，與傳統的手工直接接種法相比，可顯著提高接種效率，減少人力投入及消耗，定量接種使其接種效果高度一致并標準化，單個細菌分離數量增加；還可與實驗室信息管理系統連接實現信息化管理，留存所有的菌落圖片，保證其有效的溯源性；此外，還可用于回顧性分析，并能縮短標本周轉時間[11-13]。總之，微生物自動化的發展，推進了微生物技術的創新且日益精進，但其對標本前處理方法有一定要求，需要在常規使用前做儀器接種驗證評估性分析。