針對HBV preS1、preS2編碼鏈的反基因鎖核酸對Hep2.2.15細胞的抗病毒效果

彭 彬，許桂丹，韋武均，農(nóng)順強，陳曉昊，肖樹榮，鄧益斌

1.右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院檢驗科，廣西百色 533000；2.廣西肝膽疾病臨床醫(yī)學研究中心，廣西白色 533000

乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)感染引起的一種傳染性疾病，易發(fā)展為肝硬化和肝細胞癌[1-2]。目前，全球HBV攜帶者約有3.5億，而我國約1.3億，其中，廣西壯族自治區(qū)為HBV感染的重災區(qū)之一，在臨床上對于乙型肝炎的治療仍缺乏特效藥[3-4]。鎖核酸亦稱橋核酸，是近年來核酸研究領(lǐng)域的新熱點[5]，是一種環(huán)狀核苷酸衍生物，其核糖的2′-O與4′-C縮水形成氧亞甲基橋、硫亞甲基橋或胺亞甲基橋，形似鎖狀或橋狀。研究表明，與其他寡核苷酸相比，鎖核酸具有更強大的優(yōu)勢，如熱穩(wěn)定性強[6-7]、抗酶解能力[8-9]、與DNA或RNA相似[10]、杰出的錯配辨別力[11]、水溶性好[12]、降解半衰期長[13]等。本研究針對HBV preS1的3023-3037nt、3094-3109nt 2個位點和preS2 的3201-3215nt、3305-3320nt 2個位點分別設計合成鎖核酸序列各1條，以Lipo3000介導轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細胞株，通過觀察HBV的抑制作用，為研究新型抗HBV藥物提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 材料為HepG2.2.15細胞,其能夠在細胞上清液穩(wěn)定表達HBsAg、HBV DNA等物質(zhì)，是HepG2細胞在染色體上整合了HBV基因組的肝腫瘤細胞株，購自上海通派生物細胞庫，Lipo3000購自美國Invitrogen公司。

1.2儀器與試劑 熒光定量PCR檢測HBV DNA試劑盒購自深圳亞能生物技術(shù)有限公司；HBV HBsAg定量檢測試劑盒購自鄭州安圖生物工程股份有限公司；化學發(fā)光免疫測定儀購自鄭州安圖生物工程股份有限公司；實時定量PCR儀購自美國ABI公司。HepG2.2.15細胞常規(guī)培養(yǎng)于含G418、1%胎牛血清的高糖型DMEM培養(yǎng)基中，并于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，通過熒光定量PCR和免疫化學發(fā)光技術(shù)測量HBsAg、HBV DNA等指標，觀察鎖核酸對HBV的抑制作用。

1.3方法

1.3.1鎖核酸的設計與合成[4]從NCBI基因庫中搜索到HBV ayw亞型全基因組序列(3.2 kb DNA，NC：003977.1，GI：21326584)，利用RNA Structure 6.0軟件針對preS1編碼鏈的3023-3037nt、3094-3109nt和preS2編碼鏈的3201-3215nt、3305-3320nt 4個位點分別設計1條長度不等的反基因鎖核酸序列。3023-3037nt同聚嘌呤區(qū)：5′-CA*AA*TGCT*CCCGCT*C-3′(15 pb)；3094-3109nt同聚嘌呤區(qū)：5′-T*GT*TGTCA*ATAT*GCC-3′(15 pb)；3201-3215nt同聚嘌呤區(qū)：5′-A*GCA*GGAA*AATA*TAG-3′(15 pb)；3305-3320nt同聚嘌呤區(qū)：5′-A*AGA*TTGA*CGA*TATG-3′(15 pb)。以上各序列中，標注*號的前一個堿基進行鎖核酸修飾。各序列經(jīng)BLAST排除與人同源后由上海生物工程有限公司合成修飾并純化。

1.3.2實驗分組與細胞轉(zhuǎn)染 本實驗設空白對照組與鎖核酸-脂質(zhì)體組。鎖核酸-脂質(zhì)體組包括4個亞組，分別為封閉3023-3037nt同聚嘌呤區(qū)(3023-3037nt組)、封閉3094-3109nt同聚嘌呤區(qū)(3094-3109nt組)、封閉3201-3215nt同聚嘌呤區(qū)(3201-3215nt組)、封閉3305-3320nt同聚嘌呤區(qū)(3305-3320nt組)。以1×105個/mL細胞濃度接種于6孔板中，每組隨機各設6個復孔，待細胞貼壁達50%～60%后在各組每孔中加入鎖核酸-脂質(zhì)體藥物，轉(zhuǎn)染按照脂質(zhì)體說明書操作，隔3 d收集培養(yǎng)上清液后再次給藥，連續(xù)給藥3次，并收集3、6、9 d的上清液。

1.3.3細胞上清液HBsAg的檢測 采用化學發(fā)光免疫技術(shù)對細胞上清液的HBsAg重復檢測3次，取平均檢測值。

1.3.4HepG2.2.15細胞上清液HBV DNA的檢測 取細胞培養(yǎng)上清液500 μL加入無酶EP管中，離心后留200 μL加入450 μL DNA提取液及4 μL內(nèi)標溶液，100 ℃恒溫處理15 min，按比例取相對應的PCR反應液及Taq酶，充分混勻之后按照每管30 μL分裝到PCR八連管中，備用。往上述PCR反應管中加入處理過的待測標本核酸、陰性、強陽性、臨界陽性質(zhì)控品及不同濃度的定量參考品的上清液各20 μL，瞬時離心數(shù)秒后放置于熒光定量PCR儀中。擴增條件：92 ℃預變性2 min，93 ℃ 45 s，55 ℃ 60 s共 10個循環(huán)，93 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s 共30個循環(huán)，72 ℃ 5 min共1個循環(huán)。

1.3.5細胞代謝活性的檢測 采用CCK8比色法檢測鎖核酸對Hep2.2.15細胞代謝活性的影響，得到各組的吸光度(A)值。

2 結(jié) 果

2.1反基因鎖核酸對HBV DNA復制的抑制效果 鎖核酸-脂質(zhì)體各亞組加入鎖核酸藥物后顯示，不同亞組的HBV DNA復制在3 d后開始受到抑制，且抑制效果隨時間顯著升高，鎖核酸-脂質(zhì)體各亞組與空白對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)；在HBV preS1 的3023-3037nt、3094-3109nt 2個位點中，封閉3023-3037nt同聚嘌呤區(qū)的反基因鎖核酸對HBV DNA復制的抑制效果最明顯。在HBV preS2 的3201-3215nt、3305-3320nt 2個位點中，封閉3305-3320nt同聚嘌呤區(qū)的反基因鎖核酸對HBV DNA復制的抑制效果最明顯。見表1。

2.2反基因鎖核酸對HBV DNA復制的抑制率 在HBV preS1 的3023-3037nt、3094-3109nt 2個位點中，封閉3023-3037nt同聚嘌呤區(qū)的反基因鎖核酸對HBV DNA復制的抑制效果最明顯。在preS2 的3201-3215nt、3305-3320nt 2個位點中，封閉3305-3320nt同聚嘌呤區(qū)的反基因鎖核酸對HBV DNA復制的抑制效果最明顯。見表2。

表1 反基因鎖核酸對HBV DNA復制的抑制效果

表2 反基因鎖核酸對HBV DNA復制的抑制率

2.3反基因鎖核酸對HBsAg表達的抑制效果 鎖核酸-脂質(zhì)體各亞組加入鎖核酸藥物后顯示，不同亞組的HBsAg抑制作用在3 d后開始受到抑制，且抑制效果隨時間顯著升高，鎖核酸-脂質(zhì)體各亞組與空白對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。在HBV preS1的3023-3037nt、3094-3109nt 2個位點中，封閉3023-3037nt同聚嘌呤區(qū)的反基因鎖核酸對HBsAg的抑制效果最明顯。在HBV preS2 的3201-3215nt、3305-3320nt 2個位點中，封閉3305-3320nt同聚嘌呤區(qū)的反基因鎖核酸對HBsAg的抑制效果最明顯。見表3。

2.4反基因鎖核酸對HBsAg表達的抑制率 在HBV preS1的 3023-3037nt、3094-3109nt 2個位點中，封閉3023-3037nt同聚嘌呤區(qū)的反基因鎖核酸對HBsAg的抑制效果最明顯。在HBV preS2 的3201-3215nt、3305-3320nt 2個位點中，封閉3305-3320nt同聚嘌呤區(qū)的反基因鎖核酸對HBsAg的抑制效果最明顯。見表4。

表4 反基因鎖核酸對HBsAg表達的抑制率

2.5CCK8比色法檢測鎖核酸對Hep2.2.15細胞代謝的影響 用藥9 d后,3023-3037nt組、3094-3109nt組、3201-3215nt組、3305-3320nt組的A值分別為2.209±0.006、2.211±0.007、2.208±0.009、2.210±0.011，空白對照組的A值為2.207±0.008，鎖核酸-脂質(zhì)體組各亞組與空白對照組比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

3 討 論

HBV是由約3.2 kb堿基對組成的相對松弛不完全雙鏈DNA環(huán)狀分子，共有4個開放讀碼區(qū)，即S、C、P、X區(qū)，其中，S、C區(qū)序列是保守區(qū)，也是基因治療的理想靶位[14-16]。在編碼HBsAg的S基因5′末端有編碼能力的核苷酸序列，稱為preS區(qū)，可分為preS1區(qū)和preS2區(qū)，對應編碼的是preS1蛋白和preS2蛋白。preS1蛋白位于表面抗原大分子蛋白的N末端，由109～119個氨基酸組成，preS2基因起始于第3 172位核苷酸，終止于第833位核苷酸。

本研究分別針對HBV preS1的3023-3037nt、3094-3109nt 2個位點和preS2 的3201-3215nt、3305-3320nt 2個位點設計鎖核酸序列,通過Lipo3000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染入HepG2.2.15細胞內(nèi)，通過檢測空白對照組和鎖核酸-脂質(zhì)體組的HBV DNA復制和HBsAg表達等來評價不同位點鎖核酸的療效，實驗結(jié)果顯示，preS1的3023-3037nt位點每隔3 d連續(xù)3次對應給藥之后，對HBsAg表達的3次抑制率分別為(36.17±3.26)%、(49.62±4.36)%、(61.94±4.11)%，對HBV-DNA復制的3次抑制率分別為(26.96±3.63)%、(38.31±4.03)%、(56.08±3.22)%；3094-3109nt對HBsAg表達的3次抑制率分別為(28.75±4.22)%、(37.07±4.31)%、(40.22±4.21)%，對HBV-DNA復制的3次抑制率分別為(22.16±4.22)%、(37.26±5.07)%、(40.24±4.54)%；3201-3215nt對HBsAg表達的3次抑制率分別為(43.28±4.36)%、(48.50±3.75)%、(68.14±5.34)%，對HBV-DNA復制的3次抑制率分別為(25.66±4.38)%、(27.14±3.24)%、(46.61±3.40)%；3305-3320nt對HBsAg表達的3次抑制率分別為(50.38±6.17)%、(57.42±4.19)%、(72.93±4.14)%；對HBV-DNA復制的3次抑制率分別為(48.68±3.42)%、(52.96±3.61)%、(61.79±3.40)%。由此可看出，preS1編碼鏈的3023-3037nt的抑制效果較好，preS2編碼鏈的3305-3320nt的抑制效果較好，而相對于preS1的3023-3037nt，preS2的3305-3320nt抑制效果較高，可更有效地通過HepG2.2.15細胞的核孔進入到細胞核內(nèi)，與基因組cccDNA的編碼鏈相結(jié)合并形成三鏈雜交分子，在細胞核的復制和轉(zhuǎn)錄水平發(fā)揮抗病毒效果，具體的機制還有待進一步的研究，此外，通過CCK8比色法證實鎖核酸-脂質(zhì)體各亞組對細胞的代謝活性無明顯毒性作用。

綜上所述,通過探究preS1 的3023-3037nt、3094-3109nt 2個位點和preS2 3201-3215nt、3305-3320nt 2個位點，采用實時定量PCR、化學發(fā)光免疫分析技術(shù)觀察HBV DNA、HBsAg等抗病毒指標，這為preS1、preS2的靶位提供了理論和實驗依據(jù)，也為HBV的藥物治療提供了有效的靶位。