血清miR-139-5p、miR-146b-5p水平在乳腺癌診斷中的臨床價值

唐志金，于海文，沈 華

上海嘉定區南翔醫院普外科，上海 201802

乳腺癌是普外科常見腫瘤，其發病率逐年升高，嚴重威脅著女性的健康。其治療方法主要有手術、化療和放療等，雖然治療的療效得到極大改善，但復發和轉移仍然得不到有效控制，是導致死亡的重要原因。乳腺癌早診斷和早治療是提高預后的關鍵，臨床上對乳腺癌的診斷主要依靠B超、鉬靶和CT等傳統檢查方式，仍然缺乏特異性的檢測指標[1]。微小RNA(miRNA)是近年來發現的一類調控基因表達的小分子RNA，與腫瘤的發生、發展具有密切關系，是潛在的診斷和藥物治療的靶點，同時，血液中的miRNA具有穩定性好、可長期保存和耐降解等特點，是篩查和診斷腫瘤的潛在生物標志物[2]。有研究證實，血清miR-139-5p、miR-146b-5p在乳腺癌篩查中出現異常表達[3]。本研究通過對乳腺癌患者血清miR-139-5p、miR-146b-5p進行檢測，觀察其在乳腺癌早期診斷中的臨床價值，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2017年1月至2018年12月在本院診治的乳腺癌患者117例為乳腺癌組，患者年齡39～79歲，平均(53.64±6.17)歲；病理類型：浸潤型導管癌61例，浸潤型小葉癌56例；TNM分期：Ⅰ期32例，Ⅱ期43例，Ⅲ期42例；分化程度：低分化49例，中高分化68例。選擇同期在本院就診的乳腺纖維腺瘤患者75例為乳腺纖維腺瘤組，患者年齡42～79歲，平均(54.13±7.16)歲。選擇同期在本院體檢健康者45例為健康對照組，年齡40～79歲，平均(53.49±8.16)歲。納入標準：乳腺癌、乳腺纖維腺瘤患者均經病理確診。排除標準：(1)其他部位的惡性腫瘤；(2)術前經放療或者化療；(3)臨床資料不全；(4)血液性和免疫性疾病；(5)智力障礙或者精神性疾病。3組研究者的年齡等基線資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。所有研究者均知情同意并簽署知情同意書，本研究經本院倫理委員會審核通過。

1.2方法

1.2.1血清標本留取和指標的檢測 患者入院時和手術后1周分別抽取肘靜脈血2 mL，放置于乙二胺四乙酸抗凝管中。采用離心機將血液離心，離心半徑為15 cm，3 000 r/min離心15 min，抽取上清液放置于除酶管內，置-70 ℃冰箱中保存。血清糖類抗原(CA)153水平采用酶聯免疫吸附試驗法，使用瑞士羅氏公司生產的全自動電化學發光免疫分析儀E-170檢測，測定試劑盒及質控品為儀器配套產品。

1.2.2實時熒光定量PCR(qPCR) 總RNA的提取：采用mirVana PARIS Kit(Ambion公司，美國)試劑盒提取和純化miRNA，在血清200 μL中加入1 000 μL的溶解試劑，靜置于室溫下15 min，根據試劑盒說明書提取血清中的RNA，并用DEPC溶解總RNA。通過試劑盒將RNA反轉錄為cDNA，根據試劑盒One Step PrimeScript miRNA cDNA Synthesis Kit，將PCR參數設定為：37 ℃ 60 min，85 ℃ 5 s。qPCR：采用TaqMan?miRNA反轉錄試劑盒將提取的miRNA反轉錄成cDNA ，根據使用說明書配制20 μL的qPCR反應體系，并進行PCR的擴增。根據設計軟件primer express 3.0合成qPCR檢測引物探針。miR-139-5p上游引物序列：5′-CTC TGC TCT ACA GTG CAC GTG TC-3′；下游引物序列：5′-TAT GGT TGT TCT CGA CTC CTT CAC-3′。miR-146b-5p上游引物序列：5′-CAA CCT TGA GAA CTG AAT TCC ATA-3′；下游引物序列：5′-AAA GGT TGA TCT CGT CTC TCT GTC-3′。U6的上游引物序列：5′-ATT GGA ACG ATA CAG AGA AGA TT-3′；下游引物序列：5′-GGA ACG CTT CAC GAA TTT G-3′。 采用Maxima SYBR Green qPCR Kit (Thermo scientific公司，美國)，根據試劑盒說明書，設計反應條件：95 ℃進行15 min的預變性，循環參數設置為94 ℃變性15 min，在55 ℃退火30 s，并在72 ℃延伸30 s，總共反應40個循環，根據溶解曲線設置熒光信號。以U6為內參[4]，結果以2-ΔΔCt表示相對表達值，其中ΔΔCt=(Ct實驗組目的基因-Ct實驗組U6)-(Ct對照組目的基因-Ct對照組U6)。

1.2.3觀察指標 觀察各組血清miR-139-5p、miR-146b-5p、CA153水平的變化及診斷效能。

2 結 果

2.13組血清miR-139-5p、miR-146b-5p和CA153水平的變化 乳腺癌組術前血清miR-139-5p、CA153水平高于乳腺纖維腺瘤組(t=11.997、6.534，均P<0.001)和健康對照組(t=14.848、18.362，均P<0.001)，乳腺纖維腺瘤組明顯高于健康對照組(t=3.406、32.505，均P<0.001)，乳腺癌組術后血清miR-139-5p、CA153水平較術前明顯降低(t=15.667、17.540，均P<0.001)。乳腺癌組的術前血清miR-146b-5p水平明顯低于乳腺纖維腺瘤組(t=10.937，P<0.001)和健康對照組(t=7.637，P<0.001)，乳腺纖維腺瘤組明顯低于健康對照組(t=3.285，P=0.002)，乳腺癌組術后血清miR-146b-5p水平明顯高于術前(t=17.540，P<0.001)。見表1。

表1 3組血清miR-139-5p、miR-146b-5p和CA153水平的變化

2.2血清miR-139-5p、miR-146b-5p和CA153水平在乳腺癌中的診斷效能 與CA153比較，血清miR-139-5p(P=0.001)和 miR-146b-5p(P=0.007)對乳腺癌具有更高的診斷效能。通過對miR-139-5p和 miR-146b-5p指標的Logistic回歸分析得到方程Y=1.325XmiR-139-5p-1.334XmiR-146b-5p+1.281，miR-139-5p和 miR-146b-5p聯合檢測的靈敏度為86.6%，特異度為89.3%，曲線下面積(AUC)為0.930，明顯高于miR-139-5p(P=0.006)和 miR-146b-5p(P=0.001)單項檢測，而miR-139-5p與 miR-146b-5p比較差異無統計學意義(P=0.415)。見表2。

2.3乳腺癌血清miR-139-5p和miR-146b-5p水平的相互關系 乳腺癌血清miR-139-5p水平與miR-146b-5p水平呈負相關(r=-0.765，P<0.05)。

2.4血清miR-139-5p和miR-146b-5p水平與臨床指標的相關性 血清miR-139-5p和miR-146b-5p水平與淋巴轉移、TNM分期和分化程度具有明顯相關性(P<0.05)，與年齡、腫瘤直徑、雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)、人類表皮生長因子受體2(HER-2)和病理類型無明顯相關性(P>0.05)。見表3。

表2 血清miR-139-5p、miR-146b-5p和CA153水平對乳腺癌的診斷效能

表3 血清miR-139-5p、miR-146b-5p水平與臨床指標的相關性

3 討 論

隨著對乳腺癌研究的深入，越來越多學者認為miRNA的表達在細胞生命活動信號轉導調控中具有重要調控作用，可參與細胞增殖、分化和血管生成等生命活動過程。miRNA在血清等多種體液中具有不同程度表達，且表達相對穩定，多次凍融不易被分解，可以長期保存，同時具有以下特點[5-7]：(1)組織特異性，不同組織具有不同的miRNA，可以作為某一細胞的組織特異性標志物；(2)保守性，不同細胞或組織之間具有相同或者相似的miRNA序列；(3)時空特異性，不同發育階段具有不同的miRNA表達；(4)執行一定的生物能力，對生命活動具有一定的調節作用。

本研究發現，乳腺癌患者術前血清miR-139-5p水平明顯高于乳腺纖維腺瘤組和健康對照組，而乳腺纖維腺瘤組又明顯高于健康對照組，乳腺癌組術后血清miR-139-5p水平較術前出現明顯降低，說明miR-139-5p參與了乳腺癌的發生、發展過程。miR-139-5p在乳腺癌中的研究較少[8-9]，而在其他腫瘤如結腸癌、宮頸癌和甲狀腺癌中有異常表達[10-12]。在結腸癌的研究中發現，miR-139-5p在癌組織較在正常組織表達明顯下降，且與腫瘤的分期相關，上調能夠顯著抑制結腸癌的轉移潛能和藥物抵抗，促進腫瘤細胞的凋亡。在一項前列腺癌的研究中發現，miR-139-5p在肝癌組織中呈低表達，而在癌旁組織中呈高表達，在前列腺癌的研究中為抑癌基因[13]。而鄭奮薇等[14]研究表明，前列腺癌復發組血清miR-139-5p水平明顯高于未復發組，復發轉移患者血清miR-139-5p水平與腫瘤分期、Gleason評分和血清前列腺特異抗原水平具有明顯相關性，并認為血清miR-139-5p水平對預測前列腺癌復發和轉移具有重要的臨床價值。本研究中，miR-139-5p在乳腺癌中表現為癌基因的作用，并且其表達強度與淋巴轉移、TNM分期和分化程度有明顯相關性，而與年齡、腫瘤直徑、ER、PR、HER-2和病理類型無明顯相關性。本研究結果顯示，當血清miR-139-5p>2.22，其靈敏度為89.3%，特異度為76.1%，AUC為0.873，AUC明顯高于CA153的0.717，說明miR-139-5p對診斷乳腺癌具有更高的靈敏度和特異度。

本研究結果顯示，乳腺癌組的術前血清miR-146b-5p水平明顯低于乳腺纖維腺瘤組和健康對照組，乳腺纖維腺瘤組低于健康對照組，乳腺癌組術后血清miR-146b-5p水平明顯高于術前，說明miR-146b-5p是乳腺癌的保護基因，與乳腺癌的發生、發展具有一定相關性。miR-146b-5p定位于染色體10q24-26，在不同的組織表達不同，肺、脾臟和胸腺中呈高表達，在非小細胞肺癌、結腸癌和胰腺癌中呈低表達[15-17]。有研究證實，miR-146可以通過調節白細胞介素和腫瘤壞死因子等抑制天然免疫反應[18]。在一項胰腺癌的研究中發現，miR-146b-5p在6株胰腺癌細胞株中呈低表達，而在正常胰腺組織中呈高表達[19]。本研究結果證實，血清miR-146b-5p水平與淋巴轉移、TNM分期和分化程度有明顯相關性，而與年齡、腫瘤直徑、ER、PR、HER-2和病理類型無明顯相關性，說明血清miR-146b-5p表達水平是預后的重要因素。本研究結果顯示，當血清miR-146b-5p≤3.19，其靈敏度為92.3%，特異度為65.3%，AUC為0.842，AUC明顯高于CA153的0.717，說明其對乳腺癌的診斷效能明顯優于CA153。miR-139-5p和miR-146b-5p聯合檢測能夠明顯提高乳腺癌的診斷效能，其靈敏度為86.6%，特異度為89.3%，AUC為0.930。本研究結果顯示，血清miR-139-5p與miR-146b-5p呈負相關，說明miR-139-5p和miR-146b-5p兩者在診斷乳腺癌方面具有一定的互補性，miR-139-5p類似于癌基因，miR-146b-5p類似于抑癌基因，其具體機制需要進一步研究。

總之，miR-139-5p和miR-146b-5p參與了乳腺癌的發生、發展過程，對乳腺癌的診斷具有較高的靈敏度和特異度。