CDK20在肺腺癌中的表達及預后意義

王 欣，任英紅，丁 鵬，王力宏，荊冠軍，謝英瑛，劉維帥

陜西省商洛市中心醫院：1.腫瘤科；2.病理科，陜西商洛726000；3.陜西省楊凌示范區醫院病理科，陜西咸陽 712100

肺癌作為一種發病率最高的惡性腫瘤，嚴重損害人類的健康。目前，肺癌的5年生存率還不足15%，雖然肺癌研究不斷推進和發展，新型藥物也不斷研發，但是并沒有顯著提高肺癌患者總生存期，也沒有明顯降低其發生率[1]。非小細胞肺癌作為肺癌的主要類型，約占85%，近些年國內外流行病學研究顯示，非小細胞肺癌病理類型分布比例發生了變化，肺腺癌所占比例上升，甚至超過了肺鱗癌的發病率[2]。

CDK20是細胞周期蛋白依賴性激酶家族最新發現的成員。自2004年發現CDK20敲除對人類宮頸癌細胞Hela細胞的生長抑制作用以后，越來越多的研究顯示，CDK20作為癌基因在腫瘤發生、發展的調控機制中扮演著重要角色。在肝癌、腦膠質細胞瘤、結腸癌、肺癌、胃癌等多種腫瘤中發現，CDK20通過參與不同的信號調節通路對腫瘤細胞的生長、腫瘤的免疫微環境等發揮著重要作用[3]。本研究采用免疫組織化學法檢測CDK20在肺腺癌組織中的表達情況，分析CDK20表達與肺腺癌臨床特征之間的關系，并探討表達情況與預后的相關性，旨在探索肺腺癌靶向診療新的標志物。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2002-2017月于商洛市中心醫院進行肺癌手術切除和活檢，病理確診為肺腺癌且臨床資料完整的患者127例為研究對象。患者男65例，女62例，年齡39～75歲，平均(62.0±7.9)歲。所有患者均按照國際抗癌聯盟第八版肺癌TNM分期標準進行分期。T：原發病灶；N：淋巴結轉移；M：遠處器官轉移。臨床分期Ⅰ期18例，Ⅱ期25例，Ⅲ期32例，Ⅳ期52例，所有患者均為初治患者，術前均未行放化療。

1.2方法

1.2.1免疫組織化學染色 患者石蠟包埋的標本切片固定后脫蠟水化，加入過氧化氫室溫孵育15 min。采用PBS漂洗3次，共6 min，滴加5%BSA封閉60 min。加入一抗CDK20(Origene Technologies)后4 ℃冰箱過夜。PBS漂洗后加入二抗，室溫孵育30 min，PBS再次漂洗，加入DAB染色，蘇木精對比染色，脫水、透明、固定。結果判定：CDK20陽性為細胞質中出現棕黃色或棕褐色顆粒，細胞核為棕黃色。CDK20在肺腺癌組織中的表達按照免疫組織化學染色評分進行分析。隨機選取5個視野計算陽性細胞數量，計算染色評分，染色評分=染色深度得分×染色細胞比例得分。染色深度得分：陰性為0分，低表達為1分，中表達為2分，高表達為3分；染色細胞比例得分：0～25%為1分,>25%～50% 為2分,>50%～75%為3分,>75%為4分。染色評分0分為陰性表達組，>0～8分為低表達組，>8分為高表達組[4]。

1.2.2隨訪情況 采用門診方式持續隨訪，截止日期為2019年12月，第1年每3個月隨訪1次，之后每6個月隨訪1次，記錄肺腺癌患者相關生存時間。

1.3統計學處理 采用SPSS20.0統計學軟件進行統計分析，計數資料以率(%)表示，采用χ2檢驗；生存分析采用Kaplan-Meier法，生存率比較采用Log-rank檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1CDK20 在肺腺癌細胞中的染色特點 CDK20在肺腺癌癌組織細胞中均有不同程度的表達，肺腺癌癌組織染色強度明顯高于癌旁組織，肺腺癌癌旁組織陰性表達例數也明顯高于肺腺癌癌組織。同時，肺腺癌癌組織陽性病例的百分率也明顯高于癌旁組織(50.0%vs.5.5%)。CDK20在肺腺癌癌組織腫瘤細胞的細胞質和細胞核中均有表達，但主要表達于細胞質，陽性細胞呈棕黃色或棕褐色顆粒分布。本研究對轉移淋巴結進行染色，轉移淋巴結肺腺癌腫瘤細胞也呈CDK20高表達。見圖1、 2。

2.2CDK20表達水平與肺腺癌臨床特征的關系 肺腺癌癌組織CDK20高表達比例明顯高于癌旁組織(P<0.01)，見表1。將陰性組和低表達組進行合并以后，進行CDK20表達與肺腺癌臨床特征分析，結果顯示，肺腺癌患者不同性別、年齡與CDK20表達無明顯相關性(P>0.05)。原發灶T分期較晚的組織CDK20相對高表達，T2～T4期患者癌組織CKD20高表達占比為94.0%，T1期患者占比為6.0%。肺腺癌晚期伴有遠處轉移(M1期)的患者癌組織也呈現明顯的CDK20高表達狀態(P<0.05),有遠處轉移的患者CDK20高表達(61.25%)比例明顯高于無轉移患者(38.8%)。臨床Ⅲ～Ⅳ期CDK20高表達患者比例(88.0%)明顯高于其他分期患者比例(12.00%)。見表2。

2.3CDK20表達與肺腺癌患者預后的關系 對CDK20高表達組和陰性+低表達組患者總的生存時間進行分析，雖然CDK20高表達組總的生存期較短，但差異無統計學意義(P>0.05)。考慮到研究對象中肺腺癌晚期轉移患者的例數占比較大，進一步對晚期轉移患者(Ⅳ期)的總生存期進行分析，結果顯示，CDK20高表達的晚期轉移患者總生存期明顯短于CDK20陰性+低表達患者(P<0.05)。見圖3、4。

注：A表示肺腺癌HE染色(×100);B表示癌旁組織CDK20低表達(×200);C表示癌組織CDK20高表達(×200);D表示轉移淋巴結組織CDK20表達陽性(×200)。

注：A表示低表達;B表示中表達;C表示高表達。

表1 肺腺癌癌組織和癌旁組織中CDK20蛋白表達染色評分分組情況比較[n(%)]

表2 CDK20表達與肺腺癌臨床特征的關系[n(%)]

圖3 127例患者總生存分析生存曲線

圖4 61例Ⅳ期患者總生存分析生存曲線

3 討 論

早在2004年就有研究顯示，宮頸癌細胞中敲除CDK20后腫瘤細胞克隆生長得到明顯抑制，而這是通過活化CDK2磷酸化抑制實現的[4-5]。CDK20是含有11個保守絲氨酸/蘇氨酸的蛋白激酶，CDK20基因位于染色體上的9q22.1，基因組長度為8 kb，具有7個外顯子，并且其作為一種癌基因在包括肝癌、結腸癌、腦膠質瘤的發生、發展過程中起到重要的調控作用[5]。

本研究結果顯示，CDK20在肺腺癌組織和轉移淋巴結組織中明顯高表達。CDK20染色定位在腫瘤細胞的細胞核和細胞質，這些結果提示CDK20可能通過肺腺癌細胞的細胞質和細胞核信號通路對肺腺癌生物學特性發揮調控作用。CDK20通過調節CDK20的磷酸化，并通過影響G1/S-特異性周期蛋白(Cyclin) D1和Cyclin E來控制膠質瘤、卵巢癌和結腸癌細胞的生長和增殖。而在肝癌細胞中CDK20活化β-catenin/T細胞因子活化信號通路可促進肝癌的發生。 同時，CDK20與核因子E2相關因子2競爭，與Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白1結合，降低細胞活性氧的水平，影響放化療的敏感性[6]。這些穿梭于細胞內結構之間的CDK20信號通路調節機制使CDK20具有作為癌基因的作用。肝癌、腦膠質瘤及結腸癌臨床研究顯示，CDK20高表達患者不良預后較差，因此，CDK20可能成為臨床腫瘤預后評估的有效生物學指標[7-8]。目前，CDK20如何影響肺腺癌的機制還有待進一步研究，CDK20通過調節免疫微環境各種腫瘤相關細胞因子發揮抗腫瘤的作用，不斷更新研究者對CDK20的認識[9]。

本研究數據顯示， 61.2%有遠處轉移患者肺腺癌癌組織中CDK20高表達(>8分)。Ⅰ期和Ⅱ期總共只有8例(12.0%)患者CDK20高表達，而Ⅲ、Ⅳ期59例(88.0%)患者肺腺癌組織中CDK20高表達，遠高于Ⅰ、Ⅱ期患者比例。這些結果提示，CDK20的高表達可能參與肺腺癌的進展及促進腫瘤的遠處轉移。而在隨訪結果中，雖然CDK20高表達組患者有相對較差的預后生存期，但差異無統計學意義，進一步對Ⅳ期晚期轉移的患者隨訪數據進行分析，結果顯示，CDK20高表達組患者其生存期明顯縮短。本研究結果提示，CDK20表達強度也就是CDK20在腫瘤組織中的表達量，與肺腺癌的病情進展及轉移有關，這使得CDK20表達可能可以作為預后預測的一項重要的參考指標。已有研究顯示，CDK與肺癌有著廣泛的聯系，包括Cyclin D、Cyclin E、CDK1和CDK2等都與肺癌發生、發展相關，研究者也在進行CDK2和CDK7的抑制劑針對肺癌的作用機制研究[10-12]。目前鮮見CDK20參與肺腺癌調控作用機制和肺腺癌預后研究的文獻，尤其是用免疫組織化學這種臨床常用方法檢測分析。本研究對肺腺癌臨床標本進行CDK20免疫組織化學法染色并分析其在診斷和預后中的作用，這為進一步研究CDK20作用機制和作為治療靶點提供了線索。

綜上所述，CDK20與肺腺癌發生、發展密切聯系，CDK20高表達可能提示肺腺癌患者不良預后。這有助于深入理解肺腺癌腫瘤侵襲、轉移分子機制，對尋找新的肺癌治療靶點、預后評估有一定的參考價值。但本研究方法較單一，還有待在細胞轉錄水平和動物模型上進一步研究CDK20的表達和功能。